二、病原学诊断

二、病原学诊断

病原学诊断是指对被检家畜的粪便进行血吸虫虫卵/毛蚴检查，或者扑杀家畜后（或死亡家畜）进行血吸虫虫体及虫卵检查。常用的病原学诊断方法包括：粪便毛蚴孵化法、粪便虫卵检查法、组织虫卵检查法、虫体收集及检查法等，其中以粪便毛蚴孵化法在动物血防工作中应用最广泛。

（一）粪便毛蚴孵化法

1.材料准备

（1）器材：竹筷、40～80目/25.4 mm的铜筛滤杯（图10-1）、260目的尼龙筛兜（图10-2）、500 ml塑料量杯（洗粪杯，口径与铜筛相匹配。图10-3）、粪桶、放大镜、显微镜、吸管、载玻片、盖玻片、取暖炉、水温计、盆、水缸、水桶、剪刀、闹钟、天平、300～500 ml长颈平底烧瓶或200～250 ml三角烧瓶、脱脂棉。

（2）水：pH 6.8～7.2，无水虫和化学物质（包括氯气）污染。自来水应在盛器中存放8小时以上方可使用。河水、池水、井水、雨水等可能混有水虫的水需加温至60℃，冷却后再用；或每50 L水中加含30％有效氯的漂白粉0.35 g，搅匀，放置20小时；也可在放漂白粉后加入0.2～0.4 g硫代硫酸钠脱氯，0.5小时后再用。对混浊的水，于每50 L水中加明矾3～5 g，充分搅拌，待水澄清后用。

（3）送粪卡：卡上内容包括村名、组名、饲养员或畜主姓名、畜别、畜名或畜号、性别、年龄、怀孕状况、采粪日期。

（4）孵育室（箱）：室温低于20℃时，采用温箱或在房间内开启取暖设备，以维持20～25℃的环境条件。孵育室（箱）需满足日光或灯光的光照条件。

2.采粪和送检　采粪季节宜于春秋两季，其次是夏季，不宜于冬季。采粪的时间最好于清晨从家畜直肠中采取，或新排出的粪便。采粪量要求牛、马属动物200 g，猪100 g，羊和犬粪40 g。每份粪样需附上填好的送粪卡。

3.孵化前的粪样处理　将每头（只）家畜的粪便分三份，每份粪量为牛、马50 g，猪20 g，羊、犬10 g。然后根据粪样来源和实际情况进行如下处理。

（1）羊粪：直接进行孵化。

（2）犬粪：将粪样置于铜筛滤杯，铜筛滤杯置于尼龙筛兜之上，淋水并用竹筷搅拌至滤液清澈；再将尼龙筛兜中粪渣沥干。

（3）牛、猪和马属动物粪样：根据实际情况选用下列方法中的一种处理。①将粪样装入尼龙筛兜中，用自来水在搅拌条件下（用竹筷）淘洗至滤液清澈，沥干。②将粪样倒入铜筛中，铜筛置量杯上部，加水淹没粪样，用竹筷搅拌至稀浆状，捞出铜筛，沥干后再次浸入，搅拌，如此3次。将量杯中细渣及粪水一并倒入尼龙兜中，用水冲淘洗至滤液清澈。③将粪样倒入铜筛中，铜筛置塑料杯（带顶管塑料杯去盖和顶管）上部，加水淹没粪样，用竹筷搅拌至稀浆状，捞出铜筛，沥干后再次浸入，搅拌，如此3次。将塑料杯中粪样沉淀15分钟左右，倒去上层清液的2/3。④将粪样置于量杯或带顶管塑料杯中，加少量水搅匀，再加满水，沉淀15分钟左右，倒去上层清液的1/3～1/2。

4.孵化　根据实际情况选用下列方法中的一种，将粪样装入瓶（杯）中，放置于20～30℃环境中，在一定的光照（日光或灯光）条件下进行孵育，但不宜在阳光下孵育。夏、秋季节适用室温孵化，不需加温或降温。

（1）长颈平底烧瓶（或三角烧瓶）孵化法：将上述处理后粪样装入长颈平底烧瓶或三角烧瓶，加25℃左右清水至瓶口下4～5 cm处，在水面加1～2 cm厚的松软脱脂棉，补加清水至瓶口。使用三角烧瓶时，也可以按下述盐水瓶顶管孵化法中的方法加上顶管后进行孵化。

（2）塑料杯顶管孵化法：将上述处理后粪样装入专用塑料杯，加清水至杯口。盖上中间有孔的塑料盖，加满清水。将顶管注水至管口1～2 cm，管口蒙一层薄薄的脱脂棉，倒插入塑料盖孔中。(https://www.daowen.com)

（3）盐水瓶顶管孵化法：将上述处理后粪样装入500 ml盐水瓶，加满25℃左右清水，将试管开口端外围缠绕一定胶布（能插入盐水瓶瓶口且不漏水），试管内加水至管口1～2 cm，管口蒙一层薄薄的脱脂棉，迅速倒插入盐水瓶瓶口。

5.毛蚴观察　在孵育1小时、3小时和5小时时，将孵化杯（瓶）向着光源（或在光线充足的地方）并衬以黑色背景，肉眼或用放大镜观察。孵化猪粪时应在第5小时、8小时各观察一次。

血吸虫毛蚴肉眼观察特征为针尖大小、灰白色、梭形、折光性强，在近水面2 cm范围内作水平或斜向直线运动。血吸虫毛蚴显微观察特征为前部宽，中间有个顶突，两侧对称，后渐窄，周身有纤毛。

6.结果判定　发现血吸虫毛蚴即判定为阳性。持续观察2分钟以上仍未见毛蚴者判为阴性。如有怀疑，可用滴管将毛蚴吸出，置显微镜下鉴别。在一个样品中有1～5个毛蚴为＋，6～10个毛蚴为＋＋，11～20个毛蚴为＋＋＋，21个毛蚴以上为＋＋＋＋。可用作判断、统计血吸虫感染的强度。

7.注意事项　采集的粪样可用一次性塑料袋包装或其他简易材料（如薄膜、纸袋等）包扎，包装材料应确认没有农药、化肥等污染，以免影响毛蚴孵化。每份粪样需附上填好的送粪卡，于采粪当天送到检验室，专人登记，并在两天内开展检查。粪样一般情况下应4℃冰箱保存，也可保藏于阴凉处。一次性塑料袋包装的粪样如保藏于阴凉处，需开口，防止发酵。孵化对水、温度的要求较高，应严格按照规范进行处理和操作。

（二）解剖检查

解剖检查是指在动物尸体内检查是否有血吸虫虫体，或在组织中检查是否有血吸虫虫卵，是血吸虫病确诊的一种方法。血吸虫在宿主体内的主要寄生部位是肠系膜静脉、痔静脉，有时在门静脉、胃静脉及肝脏也能找到少量虫体，因此，在检查虫体时主要对这些部位进行冲洗收集虫体；血吸虫虫卵则主要分布于肝脏和肠壁组织，检查虫卵时主要对肝、肠组织进行压片镜检虫卵；也可用肝脏组织进行毛蚴孵化检查。

1.虫体收集与观察

（1）胃肠道血管虫体收集：牛、猪、羊宰杀后，从速剥皮，将头弯转至左侧，使动物仰卧呈偏左倾斜姿势，剖开胸腔和腹腔，暴露内脏。首先分开左右肺，找出暗红色的后腔静脉（肺静脉）并进行结扎；其次，在胸腔紧靠脊柱部位分离白色的胸主动脉，左手将其托起，右手用手术剪在血管上作一横切口，然后将连接橡皮管的金属插管从离心方向插入，并以棉线扎紧固定，橡皮管的另一端与自来水龙头连接，以便进水；第三，在左右肾脏处分别将左右肾的动静脉一起结扎，然后在髂关节和盆腔处分离左右髂动静脉，将通向后肢的髂动静脉一起结扎或以止血钳夹紧，避免冲洗液流向后肢其他部位；第四，在肝脏背面，胆囊下方，清除肝门淋巴结，仔细分离出肝门静脉，在靠肝端以棉线结扎，离肝端取与血管平行方向剪一开口，插入带有橡皮管的玻璃接管，并固定之。为防止血液凝固，接管内可事先装满5％的枸橼酸钠溶液，在插入接管时此液即会流入血管中，橡皮管的另一端接以60目铜筛，以备出水时收集虫体。以上操作结束后，即可开启自来水并逐步加大水压。翻动肠和肠系膜以利血管内水的流动。当出水无血色时，关闭龙头。为了操作便捷，分离的肝门静脉可不必进行结扎和插管，直接用两把大号止血钳夹住，然后从中间剪断，靠肝端的止血钳保持固定不动，离肝端的止血钳在放开的同时用60目铜筛接住流出的血液和虫体，然后用小号止血钳保持开口畅通和指向集虫铜筛，同上冲洗收集虫体。为保证虫体不漏失，可在动物尸体腹壁下方用大号60目铜筛收集冲洗液（手术部位示意图见图10-4）。

（2）肝脏中的虫体收集：胃肠血管内虫体收集完毕后，细心取出肝脏，防止肝组织损伤，以避免冲洗时发生漏水而影响冲虫效果。同时肝脏的后静脉应尽量留长些，便于结扎固定。取出肝脏后将其置于盆中，后腔静脉的一端以棉线结扎，另一端插入接水管，同样与自来水管相接，以备进水冲虫。然后解开门静脉的扎线（或止血钳），置入出水接管，将橡皮管导入钢丝筛中，以备出水收集虫体。操作完毕，打开自来水龙头，慢慢放水，以避免水压过大造成肝脏破裂，待至血水变清，无虫体冲出为止。肝脏虫体收集也可不取出肝脏，直接将导水管通过肺静脉近心端将冲洗液注入，从肝门静脉处收集虫体。

（3）痔静脉内的虫体检查：试验证明人工感染血吸虫的动物，包括牛、羊、猪等，大部分在痔静脉内可检获到一定数量的虫体，有时一般的冲洗方法不能把痔静脉内的虫体完全冲洗出来，必须另作检查。其方法是剖开骨盆腔取出直肠，先排出直肠内残余粪便，然后以左手伸入直肠中进行衬托，此时痔静脉充分暴露，沿痔静脉进行检查。

2.肝脏血吸虫虫卵压片　取出肝脏，肉眼观察。用眼科剪剪取白色结节，置载玻片上。每片可置4～5个结节。取另一载玻片置结节之上，压紧，用胶布或橡皮筋固定。低倍显微镜下检查。

3.肝脏血吸虫虫卵毛蚴孵化法　动物扑杀后未收集到虫体、肝脏压片未见虫卵的，可作肝组织毛蚴孵化检查。取肝组织10～20 g，剪碎，加入20 ml水，用组织捣碎机（或高速分散均质机）5 000～10 000转/分钟粉碎1～2分钟。用40目铜筛过滤，弃去滤渣，将滤液倒入60目尼龙筛兜内淘洗干净。再将尼龙筛兜内的肝组织倒入三角烧瓶或长颈平底烧瓶，按粪便毛蚴孵化法进行操作。

4.观察和结果判定　仔细检查收集虫体的铜筛和痔静脉。肝脏卵压片在低倍显微镜下检查。肝脏血吸虫虫卵毛蚴孵化结果的观察同粪便毛蚴孵化。发现血吸虫虫体，或肝组织压片发现虫卵，或肝脏孵化发现毛蚴，三者有其一，即可判断为阳性。