三、血清学诊断
血清学诊断是以发现动物血清中的血吸虫抗原或抗血吸虫抗体为依据的诊断技术，是家畜血吸虫病诊断最常用的技术之一。随着防治工作的深入，家畜血吸虫病感染率和感染度逐步下降，病原学检测方法漏检率高的不足日显突出，而血清学诊断技术具有敏感、方便、快捷等特点，在流行病学调查、群体筛查等方面有着病原学检测法不可替代的优越性，其应用也日渐广泛。
（一）血样采集
在采集血样前，对拟采集血样的家畜进行登记编号。记录每个编号家畜采集地点、饲养员或畜主姓名、畜别、畜名或畜号、性别、年龄、怀孕状况。
1.血清样本采集
（1）颈静脉采血
1）器材：12～18＃蝴蝶针、真空负压采血管（容量5 ml）（也可采用12～16＃注射针头和5 ml或10 ml离心管）、标签。
2）方法：将动物保定好，暴露动物颈部位置，在颈静脉沟1/3处剪毛消毒，用左手拇指在采血点近心端压紧，其余四指在右侧相应部位抵住，其上部颈静脉会鼓起，如鼓起不明显，可用绳子勒住颈基部使静脉鼓起；右手将采蝴蝶针在远心端对准颈静脉管刺入，用真空负压采血管接取2～5 ml血液；或插入12～16＃注射针头并用离心管接取2～5 ml血液。样品贴上标签并标注家畜编号和采集日期。
（2）耳缘静脉采血
1）器材：12～18＃蝴蝶针、真空负压采血管（容量5 ml）（也可采用12～16＃一次性注射器）、或塑料毛细管（长8 cm左右）、标签。
2）方法：①先压住动物耳根，用酒精棉球擦拭耳缘静脉，使耳静脉充分鼓起，用干棉球擦干后，将采血针或注射器刺入血管，见血后即用左手拇指按着针头，食中二指托于耳的腹面，然后放松耳根按压处，用真空负压采血管接取或直接用注射器抽取1～5 ml血液，样品贴上标签并标注家畜编号和采集日期。②在动物耳背血管处用酒精棉消毒，待酒精挥发后，用针头刺破血管，血滴流出后将毛细管插入血中，血液进入管内约5～10 cm后停止，将毛细管两端封住（可用酒精灯或用烧烫的金属镊子使塑料管烧熔封闭），样品贴上标签并标注家畜编号和采集日期。
2.血清分离、运输与保存
（1）离心管或真空负压采血管中的血样：待血样凝固后，用木签或竹签沿管壁将凝血块与管壁分离，促使血清渗出，如渗出效果不佳，于4℃3 000 r/min离心20分钟。用移液器或移液管将血清分装到灭菌试管或Eppendorf管内。
（2）毛细管中血样：将毛细管直立放置，使血球下沉，上层出现黄色血清，将血球部分毛细管剪掉，保留血清部分并将毛细管两端封住。
（3）将分离的血清分装成若干份，保藏于0～10℃或－20℃、－70℃低温冰箱。血清在0～10℃冰箱中一般仅能保持14天，并需加入0.02％叠氮钠；在－20℃冰箱中可保存3个月；－70℃低温冰箱可长期保藏。
（4）现场采集的血液或分离的血清，须在冷藏条件下运输。
3.血纸样品采集
（1）器材：高温消毒过的定性滤纸、注射针。
（2）方法：先压住动物耳根，用酒精棉球擦拭耳缘静脉，使耳静脉充分鼓起，用干棉球擦干后，以注射针刺破血管，将流出的血液滴于滤纸，自然扩散后于阴凉处晾干，标上家畜编号后放在干净白纸中（或放入小型塑料自封袋中），带回实验室，室温或4℃冰箱保存。
（二）血吸虫病血清学诊断方法
1.间接血凝试验(https://www.daowen.com)
（1）器材：V型微孔有机玻璃血凝板（孔底角90°），移液器（10～100μl）及吸头（200μl）。
（2）试剂：日本血吸虫IHA诊断液（日本血吸虫虫卵可溶性抗原SEA致敏红细胞，效价≥640，市售或由指定单位提供）、标准阴性血清（效价≤4）、标准阳性血清（效价≥640）和生理盐水。
（3）操作方法：①样本稀释：剪下1 cm×1.2 cm血纸，加200μl生理盐水，浸泡10分钟。取100μl用生理盐水作1∶2稀释。如样本为血清，则用生理盐水将血清作1∶10和1∶20稀释。②加样：取1∶10和1∶20稀释的血清或血纸浸泡液及1∶2稀释的血纸浸泡液样品各25μl，加入96孔V型微孔血凝板样品孔，每个稀释度样品加2孔。每块血凝板需设标准阳性血清、标准阴性血清和生理盐水对照。③加诊断液：每孔加25μl诊断液，震荡混匀。④孵育：室温孵育1～2小时，然后观察并判定结果。
（4）结果判读：①红细胞全部下沉到孔底中央，形成紧密红色圆点，周缘整齐为阴性（－）。②红细胞75％沉于孔底中央，形成一较阴性小的红色圆点，周围有少量凝集红细胞为弱阳性（＋）。③红细胞约50％沉于孔底中央，形成一更小红色圆点，周围有一层淡红色凝集红细胞为阳性（＋＋）。④红细胞均匀地分散于孔底，形成一淡红色薄层为强阳性（＋＋＋）。
（5）判读标准：当阳性对照血清全部为“＋＋”以上、阴性对照血清及稀释液对照均为“－”时，对受检血清诊断结果进行判定，否则检测不成立，需检查原因，重新检测。
（6）结果判定：在4个试验孔中有一孔出现“＋”以上阳性时，被检血清判为阳性。
2.胶体金试纸条诊断技术
（1）器材和试剂：血吸虫胶体金诊断试纸条（以日本血吸虫虫卵可溶性抗原为诊断抗原，市售或由指定实验室提供）、移液器（10～100μl）及吸头（200μl）、血凝板或ELISA板、PBS或生理盐水。
（2）操作方法：①在血凝板或ELISA板的孔中用PBS或生理盐水将血清按1∶10稀释到100μl；或者直接加入血纸浸泡液100μl。②将试纸条样品插入端插入血清标本孔中（血清液面请勿超过试纸条标注的刻度线），15秒后取出平放。5～15分钟内肉眼观察结果。
（3）结果判读：①阳性：检测线区（T）及对照线区（C）同时出现红色条带。②阴性：只有对照线区（C）出现一条红色条带。③无效：对照线区（C）不出现红色条带。
3.酶联免疫吸附试验（ELISA）
（1）器材：聚苯乙烯微量板（平板，40孔或96孔）、酶联免疫检测仪、移液器、离心管、烧杯、试剂瓶等。
（2）试剂：诊断抗原（日本血吸虫虫卵可溶性抗原，SEA）、辣根过氧化物酶标记的第二抗体（兔抗牛或羊或马IgG）、包被液（0.05 mol/L pH 9.6碳酸缓冲液）、稀释液/洗涤液（0.01 mol/L pH 7.4 PBS-Tween-20）、封闭液（0.2％明胶溶液/pH 7.4 PBS）、底物溶液（TMB溶液，市售）、终止液（2 mol/L H2SO4）、标准阴性血清（用粪检或解剖确定无血吸虫寄生或来自非血吸虫病疫区的牛血清10份等量混合）、标准阳性血清（用粪检或解剖诊断血吸虫感染的阳性牛血清10份等量混合）。
（3）操作方法：①包被抗原：用包被液将抗原稀释至10μg/ml，每孔加100μl，37℃温育1小时，或4℃冰箱放置过夜。②洗涤：倒尽板孔中液体，加满洗涤液，静放5分钟，倾弃洗涤液，反复3次，最后将反应板倒置在吸水纸上，使孔中洗涤液流尽。有条件实验室可以用自动洗板机洗涤。③加封闭液150μl，37℃放置1小时。同上法洗涤。④加被检血清：用稀释液将被检血清作1∶100稀释，每孔100μl。同时作标准阴、阳性血清对照。37℃放置1～2小时。再同上法洗涤。⑤将辣根过氧化物酶标记的第二抗体用洗涤液稀释到工作浓度，每孔加100μl，放置37℃1小时。同上法洗涤。⑥加底物：加100μl TMB溶液，室温或37℃避光放置10～15分钟。⑦加终止液：每孔50μl。⑧用酶联免疫检测仪测定450 nm吸光值（OD）。
（4）结果判读：用待测样本（S）和阴性对照（N）的OD值计算S/N值，如S/N值＞2则该样品为阳性。以标准阳性血清A值与标准阴性血清A值之比大于2作为本试验的质量控制。
（三）血清学诊断的应用范围
（1）血清学诊断只能作为家畜血吸虫感染的辅助诊断，作为疫情上报时，须对血清学检测阳性家畜进行进一步的病原学诊断，病原学确诊后再上报。
（2）作为筛查工具，确定药物治疗的靶动物。
（3）作为流行病学调查和监测方法，分析流行规律或防控效果。
