(二)膀胱
目前,胃肠道片段通常用于代替或修复膀胱,然而胃肠组织具有吸收功能,而膀胱组织是用来储存和排出尿液。当胃肠道组织与尿路接触时,可能会出现多种并发症,如感染、新陈代谢紊乱、尿路结石形成、穿孔、黏液分泌增加和恶变等(McDougal,1992)。由于使用胃肠道会遇到很多问题,许多研究者尝试其他的膀胱替代物或修补方法用于代替或修复膀胱的手术,如自体膀胱扩大术(Cartwright and Snow,1989a,1989b)和输尿管膀胱成形术等(Adams et al,1998)。此外,还有人开始探索用于膀胱重建的其他方法,例如使用组织扩增(Lailas et al,1996;Satar et al,1999)和细胞移植的组织工程。
1.用于膀胱再生的基质
在过去的几十年中,人们曾经尝试了很多种人工合成和有机材料作为膀胱壁替代物。已经在实验和临床环境中试用过的人工合成材料包括聚乙烯海绵、聚四氟乙烯、胶原基质、Vicryl(PGA)基质和硅胶。大多数试验品因为机械性、结构、功能及生物相容性的问题而失败。通常,应用永久合成材料重建膀胱会导致机械性失灵和尿路结石形成,而应用可降解材料则会引起成纤维细胞沉积、瘢痕、移植物挛缩以及膀胱容量逐渐减少(Atala,1995,1998)。
应用多种胶原基质来进行组织再生已成为趋势,无细胞种植的同种异体脱细胞膀胱胶原基质可以作为宿主膀胱壁细胞生长的支架,可利用物理和化学方法去除膀胱组织的细胞成分来制备这些基质(Probst et al,1997;Yoo et al,1998b)。这些基质可以作为局部膀胱再生的载体,且相关抗原性不明显。种植细胞的同种异体脱细胞膀胱基质被用于狗的膀胱扩大术(Yoo et al,1998b)。预载细胞的生物材料比脱细胞的生物材料在植入之前就表现出了更好的组织再生能力,其中组织再生依赖于来自周围组织细胞向内生长。无细胞胶原基质可以用生长因子促进膀胱再生(Kikuno et al,2009)。
SIS是一种生物可降解的脱细胞异体胶原组织基质移植材料,在20世纪60年代早期首次被描述为血管床中组织替代的脱细胞基质(Rotthoff et al,1964,1969)。该基质来源于猪小肠,这类猪小肠被机械性地去除了内侧的黏膜层和外侧的浆膜层、肌层。动物实验已经证实,用于膀胱扩大的脱细胞SIS能够在体内再生(Kropp et al,1996),组织学分析显示,再生的移行细胞层具有类似自身膀胱组织的特征。SIS作为基质的再生狗膀胱的体外收缩性实验表明,其最大收缩力较正常膀胱组织下降50%。
通过腹腔镜技术在迷你猪身上用猪小肠脱细胞基质、人胎盘膜或猪小肠黏膜下层进行扩大膀胱术实验,术后12周显示移植物收缩至原体积的60%,组织学显示主要是黏膜的再生(Portis et al,2000)。利用SIS进行膀胱半切术和膀胱替代治疗,1年后,虽然在移植物周围和中心出现了肌肉组织,但仅仅是少量的肌束和大量的纤维组织组成。与膀胱半切术导致的术后膀胱闭合相比,其顺应性和容量无明显改善(Landman et al,2004)。
多项研究表明,在使用不同材料作为无细胞种植基质进行膀胱成形术时,尿路上皮层能够正常再生,肌层虽然存在但发育不完全(Kropp et al,1996;Sutherland et al,1996;Probst et al,1997;Yoo et al,1998b;Jayo et al,2008b;Zhang,2008)。研究证实,无细胞基质可以提供细胞迁移、生长和分化所必需的环境(Chun et al,2007)。随着本领域的深入研究,这些基质材料可能在不久的将来应用于临床。
2.应用细胞移植的膀胱再生医学
具有选择性细胞移植的再生医学可能为创建功能性新膀胱片段提供一种手段(Atala,1997)。膀胱重建中细胞移植策略的成功取决于有效使用供体组织的能力,并为长期生存、分化和生长提供适宜的条件。已经探索了各种细胞来源用于膀胱再生,目前,首选自体细胞,因为它们可以在不被排斥的情况下使用(Cilento et al,1994)。羊水和骨髓来源的干细胞也可以以自体方式使用,具有分化成膀胱肌肉细胞的潜能(De Coppi et al,2007b;Shukla et al,2008)和尿路上皮细胞(Anumanthan et al,2008);胚胎干细胞也具有分化成膀胱组织的潜能(Oottamasathien et al,2007)。
3.膀胱组织的形成
人尿道上皮细胞和肌肉细胞可以在体外扩增,并种植在多聚物支架上贴壁形成细胞片。然后可以将细胞-聚合物支架植入体内。组织学分析表明,成活细胞能够自我组装成各自的组织类型,并保留其原生表型(Atala et al,1993b)。这些实验首次证明复合层状组织工程结构可以重新创建。
膀胱能够在游离移植物上再生的观点已经建立几十年了。尿路上皮具有很高的修复能力(de Boer et al,1994),而膀胱肌肉组织不太可能以正常方式再生。据资料,尿道上皮和肌肉组织都是从正常膀胱的边缘长入游离移植物(Baker et al,1958;Gorham et al,1989)。然而通常情况下,移植物的挛缩或再吸收很明显。基质的炎症反应可能促进游离移植物的再吸收。如果植入前在体外构建三维结构构建体将促进植入体内后细胞的终末分化,并使基质的炎症反应最小化,从而避免移植物挛缩和收缩。一项犬的研究证实使用自体细胞种植的基质(组织工程基质)和无细胞基质之间的差别很大(Yoo et al,1998b),用于膀胱扩大的植入细胞的基质基本保持了植入时的体积大小,而无细胞的基质移植物发生了收缩和萎缩。组织形态学表明,植入的无细胞基质中肌细胞明显量少而且具有严重的炎症反应。
为了更好地阐明组织工程膀胱的功能参数,科学家设计了一种犬的次全膀胱切除术的动物模型,随后用组织工程器官替代(Oberpenning et al,1999)。仅行膀胱切除术和使用无细胞植入的组织工程膀胱两对照组的膀胱平均容量分别为术前值的22%和46%,而使用细胞植入的组织工程膀胱实验组膀胱容量可达到术前的95%,这些结果得到放射影像学的证实(图12-5)。
在组织学上,无细胞种植的支架膀胱具有正常的尿路上皮细胞排列模式,但是黏膜下层纤维化增多,肌纤维层较薄。重建的组织工程膀胱具有正常的组织结构,由尿道上皮,黏膜下层和肌肉层组成(图12-6)。
这些基于PGA支架进行的研究结果已被其他研究人员的长期大量动物实验证实(Jayo et al,2008a,2008b)。但是,如果需要修复大面积膀胱缺损,支架再生重建体表现欠佳。在使用SIS基质支架进行犬膀胱次全置换术的研究中,无细胞和细胞种植实验组均显示移植物挛缩的不良结果(Zhang et al,2006b)。所使用的支架类型对于这些技术的成功至关重要。生物反应器的使用以及在生产器官之处接受机械性刺激,也是成功的重要因素(Farhat and Yeger,2008;Bouhout et al,2011)。
关于组织工程膀胱重建的临床试验从1998年便已开始,在一项包含7例患者的临床研究中,应用了网膜覆盖或不覆盖的细胞种植胶原支架,或网膜覆盖的细胞种植PGA-胶原支架(图12-7)。采用后种支架重建的工程化膀胱顺应性提高,最大充盈压下降,容量增加,不发生尿失禁时间延长(Atala et al,2006)。虽然这项临床研究展示了工程化组织安全植入的良好前景,但这仅仅是实现应用具有完整功能的工程化膀胱的开始。由于这些临床试验的局限性和技术尚不成熟等方面的原因,仍然需要深入的研究和临床试验来证明其可行性。目前美国食品药品管理局(FDA)二期研究已经完成。
图12-5 A.膀胱次全切未进行重建术后11个月的比格犬膀胱造影;B.通过无细胞多聚物重建后的造影;C.通过多聚物和种植细胞的组织工程器官重建后的膀胱造影。保留三角区的膀胱切除后形成一个小贮尿器官。组织工程膀胱比仅用多聚物构成的三角形移植物具有更正常的形状和更大的容积
图12-6 HE染色显示术后6个月的组织结果(250倍)。A.正常犬膀胱;B.用无细胞多聚物构成的正常尿路上皮覆盖厚层的胶原和纤维组织重建的膀胱顶部,仅可见少量的肌纤维;C.组织工程化新器官具有正常的组织形态学表现,尿路上皮、黏膜下层和肌层三层结构明显可见
图12-7 工程化膀胱的构建。A.用于膀胱修复的细胞种植支架;B.细胞种植支架与膀胱吻合后使用4-0聚乙二醇缝合线缝合;C.在植入物上覆盖纤维蛋白胶和网膜
从上述研究中可以看出,与尿道研究一样,工程膀胱组织重建过程中,附有细胞的基质明显优于无细胞的基质。近年来,尽管膀胱组织工程重建方面取得了长足的发展,但依旧面临诸多挑战。当前,多中心研究的目标是发展具有生物活性的“智能”型生物材料来改善组织再生。对于一些膀胱切除术后进行组织工程尿道植入的膀胱癌患者,这样的技术已得到应用(Hyndman et al,2012)。脂肪干细胞可以分化为尿路平滑肌细胞,从而避免使用膀胱癌患者自体尿路细胞造成的影响(Basu et al,2012)。
4.膀胱细胞疗法
尿失禁和膀胱输尿管反流都是影响泌尿生殖系统的常见病,膀胱内注射可能是有效的疗法。通过内镜治疗反流和尿失禁的理想物质应该具备可注射的、非抗原性、不迁移的、体积稳定且安全的特性(Kershen et al,1999)。为了实现这一目标,已经进行了长期研究以确定体内注射软骨细胞的作用效果(Atala et al,1993a)。该系统也适用于猪模型中膀胱输尿管的反流治疗(Atala et al,1994)。
基于细胞治疗的泌尿系统再生医学技术,通过注射软骨细胞首次应用于纠正儿童膀胱输尿管反流和成人尿失禁。一期临床试验结果显示术后3个月和12个月的成功率近80%(Bent et al,2001)。膀胱输尿管反流患者在美国的10个临床中心接受了治疗,这些患者的治疗成功率与注射其他物质的患者相似,29例儿童(47例输尿管)的总体成功率为86%。在1年的随访中,输尿管反流纠正的成功率维持在70%。在治疗失败的患者中未发现软骨细胞的形成(Diamond et al,1999)。
研究者对自体平滑肌细胞治疗技术在尿失禁和膀胱输尿管反流中的应用进行了探索(Cilento et al,1995)。迷你猪的实验表明反流可以被成功纠正。多项研究对成肌细胞在压力性尿失禁动物模型治疗中的潜在用途进行了探索(Chancellor et al,2000;Yokoyama et al,2000;Cannon et al,2003;Lee et al,2003;Strasser et al,2004;Kwon et al,2006;Mitterberger et al,2007b)。内源性肌前体细胞也被证实在损伤尿道横纹括约肌的再生过程中发挥着积极作用。用来检测这些技术的犬尿道括约肌不可逆损伤模型已经建立起来(Eberli et al,2008,2012)。其他类型的细胞治疗也被用于尿失禁,如羊水来源干细胞(Chun et al,2012;Kim et al,2012a)和脂肪来源干细胞。将脂肪干细胞注射到小鼠膀胱和尿道中,肌肉组织得到再生(Jack et al,2005;Fu et al,2010;Zhao et al,2011)。一项应用自体脂肪干细胞进行治疗的初步临床试验已经实施并获得大量的实验结果(Yamamoto et al,2012)。(https://www.daowen.com)
已有多项临床研究用于探索成肌细胞注射对压力性尿失禁的治疗效果(Mitterberger et al,2007a)。在一项包含63例患者的研究中,研究者对比了超声引导下注射自体细胞和内镜下注射胶原两种方式的有效性和患者的耐受性,结果表明前者的治疗效果更为理想。然而这项研究存在争议,论文已被撤回。在另一项研究中,将分离于腹壁脉管系统的成肌细胞注入伴有尿失禁的膀胱外翻患者体内,88%的患者白天会阴部干燥时间超过3h。这些患者也进行了盆底电刺激治疗与盆底功能锻炼(Kajbafzadeh et al,2008)。另一项包含8例患者的临床研究采用注射自体肌肉来源的干细胞治疗压力性尿失禁,1年后,1例女性患者的控尿功能完全恢复,5例获得改善(Carr et al,2008)。采用超声引导的成肌细胞治疗试验获得24%的成功率(Blaganje and Lukianovi,2012)。在过去的几年中,采用细胞疗法治疗尿失禁的应用逐渐增加,但仍需要进一步临床试验和随访以确定长期疗效。
细胞治疗的研究也被应用于放射性膀胱炎,比如一项研究将骨髓干细胞注入大鼠模型进行治疗(Imamura et al,2012)。羊水来源干细胞和骨髓来源干细胞均被用于改善帕金森动物模型中的膀胱功能障碍(Soler et al,2012)。最近,膀胱干细胞的原位再生机制逐渐被阐明,比如Hedgehog和Wnt信号通路反馈系统(Shin et al,2011)。随着再生医学相关的小分子和药物的产生,此类研究一定会取得进展(Lu and Atala,2013)。
(三)输尿管
已有多种方法用于实验性输尿管组织工程,但是这些方法还没有被植入患者中。
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(四)男性生殖器及其生殖组织
阴茎癌、创伤、严重勃起功能障碍和先天性疾病如外生殖器两性畸形、尿道下裂和尿道上裂等各种病理性阴茎疾病需要进行外科重建手术。生殖器重建手术的主要局限之一是无法获得足够的自体组织,来源于非生殖器的自体组织已被使用了几十年。20世纪30年代后期开始尝试以肋软骨作为外伤性阴茎缺损的重建加强物进行阴茎重建手术(Frumpkin,1944;Goodwin and Scott,1952)。这种涉及多次手术的方法很快因为功能和美容效果不理想而被放弃使用。刚性硅胶假体在20世纪70年代开始普及并得到广泛应用。然而,生物相容性是患者选择方面的主要问题(Thomalla et al,1987;Nukui et al,1997)。
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1.阴茎海绵体的重建
海绵体平滑肌是阴茎的主要成分之一。自体功能性和结构性海绵组织的再生将会很有用处。初期实验表明,培养的人体平滑肌细胞可以与生物可降解聚合物支架结合使用以再生海绵体组织(Kershen et al,2002)。当在胶原上生长时,海绵体内皮细胞可以形成毛细样结构进而形成复杂的三维网络结构。随后的研究证实,将海绵体平滑肌细胞和ECs种植在可降解生物聚合物支架上并移植到体内,能够形成血管化的海绵体肌(Park et al,1999)。天然来源的脱细胞海绵体基质已被生产出来,它与原来的海绵体具有相同的结构,这种无细胞基质来源于细胞裂解技术处理的供体兔海绵体。人海绵体细胞和内皮细胞取材于供体阴茎组织,体外扩增后种植于无细胞基质上,4周后该基质被正常的细胞结构覆盖(Falke et al,2003)。这种组织来源的细胞附着的基质为血管海绵体平滑肌的构建提供了足够的框架基础。
为了探索工程化海绵体的功能参数,研究者从供体兔的阴茎组织获取脱细胞平滑肌胶原基质,并获取自体的阴茎海绵体平滑肌细胞和内皮细胞,扩增后种植于该基质上,随后对实验兔的阴茎海绵体进行环形切割并保持尿道完整,将构建好的基质植入到该部位。6个月后对功能和结构参数进行测量(包括阴茎海绵体造影术、海绵体压力检测、交配行为检测和射精功能检测),并且进行组织化学、免疫细胞化学和蛋白免疫印迹分析,结果显示工程化阴茎海绵体组织在结构和功能参数等方面获得满意效果(Kwon et al,2002)。利用工程化海绵体组织对整体阴茎海绵体进行置换的实验进一步证实了这项技术的可行性(图12-8)。
阴茎海绵体造影术显示了结构的完整性,压力检测结果证实了其与正常对照组具有相似的压力(图12-9)。
在整个实验过程中,阴性对照组缺乏正常的勃起功能,而置入工程化海绵体的实验动物在1个月后便出现正常的交配活动,并且在交配过程中全部完成射精,与之交配的雌兔亦能受孕并生产仔兔。只移植了无细胞基质的雄兔不能正常交配和完成射精。大体结果表明,种植了细胞的工程化海绵体植入物可以与本体组织连接在一起,表现出良好的连续性和完整性,组织学观察到海绵体窦状间隙以及壁上有平滑肌和内皮细胞附着, 而未种植细胞的移植物内含有纤维化组织和钙化物,仅有疏松的海绵体成分,并且每种细胞成分都经过免疫细胞化学和蛋白免疫印迹实验得到证实。移植6个月后工程化海绵体组织能够在电场和药物的刺激下收缩和舒张,收缩反应与正常海绵体组织相似(Chen et al,2010)。
图12-8 用于组织工程的自体海绵体细胞的分离和培养。A.研究的整体设计;B.培养扩增的内皮细胞(左)显示细胞特异性标志物von Willebrand因子(vWF)蛋白的阳性表达,平滑肌细胞显示平滑肌特异性α-肌动蛋白(α-actin)的阳性表达(右)
图12-9 海绵体压力检测和海绵体造影术。A.海绵体压力检测结果表明阴茎海绵体完整切除后进行工程化海绵体置换,海绵体内压力(intracorporeal pressure,lCP)足以维持勃起功能(n=12),lCP水平与正常海绵体相当(n=12);B:海绵体造影术结果显示工程化海绵体(n=12)与正常海绵体(n=16)具有相似的外观,置入未种植细胞移植物的对照组(n=12)出现较多的充盈缺损,阴性对照组出现大量的充盈缺损(n=3)
上述的一系列研究表明阴茎海绵体组织可以进行组织工程化。实验中组织工程能够使其在勃起、交配、射精、致孕和分娩等方面获得理想的结构和功能参数。然而,工程化器官长期的功能状况需要进一步研究来证明。另外,人体组织是否能够工程化也需要进一步验证。
2.阴茎细胞疗法
各种细胞疗法已被提出并实验性用于勃起功能障碍治疗。ECs已用于逆转勃起功能障碍动物模型(Gou et al,2011)。间充质干细胞可以单独使用或与基质组合使用来改善小鼠的勃起功能(Lin et al,2011;Kim et al,2012b)。人骨髓来源干细胞在注射到大鼠阴茎海绵体后功能得到改善(Qiu et al,2011;You et al,2013)。肌肉来源的干细胞可预防大鼠阴茎海绵体损伤后勃起功能障碍(Kovanecz et al,2012)。脂肪干细胞也被用于啮齿类动物,结果显示无论是否有生长因子的协助海绵体损伤都会得到逆转(Orabiet al,2012;Qiu et al,2012;Ryu et al,2012;Liu et al,2013)。类似的细胞也被用于治疗阴茎纤维性海绵体炎(Castiglione et al,2013)。各种细胞治疗正在向临床过渡,尚需要长期研究来评估这些疗法的全面影响。
3.睾丸
睾丸间质细胞是男性睾酮生成的主要来源。睾丸功能障碍患者需要雄激素替代治疗来促进机体发育。睾丸功能障碍的常规治疗包括周期性肌内注射化学性睾酮或近期应用的皮肤贴片。然而,长期的非脉冲性睾酮治疗并不是最佳的,可能引起多种问题,包括红细胞生成和骨密度变化等。
为控制睾酮替代治疗,设计了一个睾丸间质细胞微囊化系统,该系统具有多种优点,如移植细胞与宿主免疫系统之间的半透性屏障系统,以及维持睾酮长期的生理释放。分离纯化的睾丸间质细胞并包封于藻酸盐聚赖氨酸溶液中。将包被的睾丸间质细胞注入去势的动物体内并连续测定血清睾酮,动物能够长期维持稳定的睾酮水平(Machluf and Atala,1998)。这些研究表明,微囊化睾丸间质细胞系统在无睾症或睾丸衰竭存在的情况下可以替代或补充睾酮。另外,还存在一种分离睾丸间质干细胞和研究睾丸间质细胞发育的新技术(Lo et al,2004)。该技术可以成功地将功能性睾丸间质干细胞移植到性腺功能减退患者中,表明睾酮的重新合成是具有可行性的。
进一步研究表明,在生物反应器中用软骨细胞生成的睾丸假体可以装载睾酮。将假体植入双侧无睾丸的无胸腺小鼠,可以长期释放睾酮以维持雄激素水平在生理范围内(Raya-Rivera et al,2008)。人们可以设想将先前描述的睾丸间质细胞技术与工程化假体相结合用于雄激素水平的长期功能替代。
在过去的几十年中,不育患者的生精能力一直是人们关注的主要领域。小鼠精原干细胞移植技术的发现,为男性不育治疗领域开辟了新的途径(Brinster and Zimmermann,1994)。自从发现精原干细胞分离技术和自体移植的可行性以来,它已在包括非人灵长类在内的几个物种中得到证实。人类精原干细胞在2002年首次成功分离表明,这些细胞能够在小鼠受体睾丸中定植并存活达6个月(Nagano et al,2002)。在此之前该课题组已经证实,雄性小鼠生殖能力在接受生殖系干细胞移植后得到恢复(Ogawa et al,2000)。支持细胞(Sertoli细胞)是睾丸生殖细胞周围的主要成分,也能够恢复小鼠的生育能力(Kanatsu-Shinohara et al,2005)。最近,在先前通过烷基化化疗致其不育的成年和处于青春期前的猕猴睾丸中进行自体和同种异体精原干细胞移植获得成功(Hermann et al,2012)。来自成人和青春期睾丸的人精原干细胞的体外增殖系统已经建立(Sadri-Ardekani et al,2009)。在这些系统中,人类精原干细胞由来自同一患者睾丸体细胞的滋养层支持。人类精原干细胞可以在体外维持15周以上(Sadri-Ardekani et al,2011)。基于FDA法规和CGTP要求,优化这种培养体系在用于临床之前是必不可少的。