(六)肾的结构
虽然肾是第一个用人造装置替代的器官和第一个成功移植的器官(Guild et al,1955),但目前的治疗方式远不能令人满意,透析仍是肾衰竭最常见的治疗方法。肾组织是实验室中最难复制的组织之一。肾是一个复杂的器官,其独特的结构和细胞异质性为研究带来许多挑战。肾的肾单位和集合管系统由多个功能和形态不同的部分组成。为此,必须提供适当的条件以确保许多类型细胞的长期存活、分化和生长。肾组织再生领域的研究集中在可靠细胞来源的开发上(Prockop,1997;Kale et al,2003;Lin et al,2003;Ikarashi et al,2005;Lin et al,2005;Yokoo et al,2005)。此外,最佳生长条件已被广泛研究以建立稳定的肾细胞扩增系统(Milici et al,1985;Carley et al,1988;Humes et al,1992;Schena,1998)。
分离产生特定因子的特定细胞类型可能是选择性细胞治疗的好方法。例如,产生促红细胞生成素的肾细胞已在培养中分离出来,这些细胞最终可用于治疗终末期肾功能衰竭导致的贫血(AbouShwareb et al,2008;Gyabaah et al,2012)。这些细胞也被用于改善慢性肾疾病模型中的肾功能(Yamaleyeva et al,2012)。特定的肾来源的原代细胞已被广泛研究并用于功能重建 (Guimaraes-Souza et al,2012),更为长远的目标是努力实现全部肾功能的替代。为了培养出能够提供全部肾功能的肾组织,应该使用具有功能肾单位的所有细胞类型的培养物。培养肾细胞的最佳培养条件已被广泛研究,并且有报道表明在这些条件下生长的细胞能够维持其细胞特征(Lanza et al,2002)。通过初始细胞核移植过程获得的细胞已从克隆组织中回收并扩增。而且,置于三维培养环境中的肾细胞能够重建为肾组织的结构。将体外培养的肾组织植入大鼠肾囊区,可以血管化形成肾小球(Joraku et al,2009)。
最近,寻找可靠细胞来源方面的研究工作已经扩展到干细胞和祖细胞。利用这些细胞进行组织再生具有很好的发展前景,因为它们能够分化并成熟为所需的特定细胞类型。当原代肾细胞由于广泛地组织损伤而不可用时,这种方式十分有用。骨髓间充质干细胞已被证明是一种潜在的来源,因为它们能够分化成几种细胞谱系(Ikarashiet al,2005)。建立适当的肾功能衰竭实验模型对于各种细胞疗法的检测至关重要(Wang et al,2013)。已有报道表明,当骨髓间充质干细胞置于大鼠胚胎发育的环境中时,使其持续暴露于肾生长信号的指令下,进而参与肾发育(Yokoo et al,2005)。在缺血性肾损伤模型中肾再生的主要细胞主要来源于肾内细胞(Lin et al,2005)。骨髓间充质干细胞在小鼠体内的全身给药可预防各种动物模型的肾损伤(Humphreys and Bonventre,2008;Lin,2008;Morigi et al,2010)。在一项初步研究中,自体骨髓细胞已被临床用于治疗移植后的同种异体移植物排斥反应(Reinders et al,2013)。骨髓来源干细胞和原代肾细胞的其他相关实验正在进行中,目前尚无定论结果。
其他干细胞类型,如h ESCs(Lin,2006;Bruce et al,2007),诱导多能干细胞(Osafune,2010;Song et al,2012),人羊水干细胞和胎盘干细胞(Perin et al,2007;Hauser et al,2010)也可导致动物模型中肾分化和肾损伤的逆转。肾再生的发展方法也已被研究,但是主要停留在研究层面,并不能直接应用于临床。
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肾重建的再生医学方法:肾细胞的生长和扩增能力是组织工程的基本要求之一。已有研究证实了使用再生医学技术实现肾细胞生长、扩增和体内重建的可行性(Atala et al,1991)。将包括远端小管、肾小球和近端小管的供体兔肾细胞在体外分开铺板,并在扩增后接种到可生物降解的PGA支架上。组织学检查显示,随着时间的推移,聚合物纤维内的肾单位组织结构逐渐成形。这些结果表明,特异性肾细胞可以成功地提取和培养,随后可以附着到可降解的人工生物聚合物上。然而,目前还不清楚形成的管状结构是从分散的肾原件中重新构成,还是仅仅为原始解离和培养过程中存活的完整的供体小管片段。进一步的实验研究解释了这个问题 (Fung et al,1996)。对小鼠肾细胞采集并培养扩增,随后,将单个分离的细胞接种在可生物降解的聚合物支架上,并植入免疫功能相同的宿主中,可以观察到肾上皮细胞在体内重建为管状结构。随着时间的推移,提取植入物进行连续分析表明,肾上皮细胞首先形成实心的索状结构,随后在2周内可以看到形成中空的管道。肾单位片段特异性乳糖的组织学检查显示近端肾小管、远端小管、髓襻、集合小管和集合管成功重建。这些结果表明,单个悬浮细胞能够重建为管状结构,每个细管内具有同质细胞类型。(https://www.daowen.com)
在随后的研究中,小鼠肾细胞被采集、培养后扩增,并接种到由聚碳酸酯构成的管状装置上(Yoo et al,1996)。管状装置的一端连接到终止于储液器的硅橡胶导管,该装置被植入无胸腺小鼠的皮下。植入装置的组织学检查显示了广泛的血管化以及肾小球的形成和高度组织化的管状结构,近端和远端肾小管细胞和髓襻升支细段细胞。从储液器收集的液体表明,小管能够单向分泌和浓缩尿酸。与血清相比,收集的液体肌酐浓度增加了8.2倍。这些结果表明,来自多细胞结构的单个细胞可以再生成有功能性的肾单位,能够通过尿样液体排出高浓度的溶质(Yoo et al,1996)。
为了确定是否可以使用替代细胞形成肾组织,研究者通过核移植(治疗性克隆)生产具有组织相容性的组织,并对使用这些克隆细胞在体内合成同基因工程化肾组织的可行性进行了分析(Lanza et al,2002)。将牛皮肤成纤维细胞的核物质转移到未受精的去核供体牛卵细胞中,获取来自克隆胚胎的肾细胞,在体外扩增后接种到三维肾支架上。将这些三维支架植入到克隆细胞来源的牛的背部,并在12周后取出检测,发现产生了有功能的肾单位(图12-11)。
移植回核供体动物后,移植物产生尿液并具有活性,化学分析结果显示尿素氮和肌酐的浓度并说明其具有单向分泌的功能。显微分析显示,肾小球和管状组织结构的形成;免疫组化和反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)分析证实,肾信使RNA(m RNA)和蛋白质的表达。这些研究表明,来源于核移植的细胞可以成功提取、培养和扩增,并使用可降解的生物支架进行体内移植,其中的单个悬浮细胞可以形成与宿主基因相同的组织结构。这些研究首次证明了治疗性克隆用于体内组织再生。
图12-11 治疗性克隆与组织工程生产的肾组织。A.组织工程肾单位图解;B.克隆细胞种植于肾单位上,移植3个月后,显示能收集“尿液”;C.在发育成熟的肾小球、相连肾小管和聚碳酸酯膜之间有非常清楚的单向连续性;D.酶联免疫斑点法分析同种异体肾细胞、克隆肾细胞及核供体成纤维细胞在初次刺激和二次刺激后T细胞分泌γ干扰素的频率
具有三维肾结构的天然组织来源的基质优于上述实验中使用的人工基质,因为它允许移植更多数量的细胞,重建更大体积的肾组织。因此,开发了与天然肾结构类似的无细胞胶原肾基质。随后的研究证实了这些胶原基质是否可以容纳大量的肾细胞,并在体内形成肾脏组织结构(Amiel et al,2000)。种植在基质上的肾细胞黏附到基质内表面,7d后增殖汇合。植入8周后观察到肾小管和肾小球样结构。最近的数据证实,使用脱细胞肾基质并种植细胞来创建更大肾组织结构是可行的(Orlando et al,2012;Sullivan et al,2012;Arenas-Herrera et al,2013)。