纤维素酶的诱导合成及调节控制
木霉真菌是迄今报道形成和分泌胞外纤维素酶活力最高，成分最全面的菌种［29，33］。但有时细菌，特别是反刍动物中纤维分解细菌的纤维素酶活性很高［36］。Smith等报道Ruminococcus album纤维素酶部分被O2抑制［38］。这也许可解释反刍动物中分离活性纤维素酶的困难。我组分离的中温好氧产黄色纤维单胞杆菌分解纸浆纤维的能力也很强，而且同另一株伴生菌（腐臭假单胞杆菌）间有协同作用［39］。
木霉菌种的纤维素酶活力可以通过诱变而提高［11，12，40］。诱变后高产变异株的特点是菌落小、生长差、孢子形成少［12］。美国Natick实验室的QM60（绿色木霉）经线性加速器处理，得到酶活增加1倍的QM9123［40］，又经60钴、紫外线和亚硝基胍等处理，得到活力更高的QM9414。据Reese1975年报道，该菌株是目前国际上液体培养活力最高的菌株，在最佳培养条件下，培养二周，摇瓶中达到的纤维素酶最高活力是：CMC活力为100单位/毫升，滤纸分解活力为5.0毫克葡萄糖/毫升酶·小时，棉花活力是9毫克葡萄糖/毫升酶·24小时［6］。我组选育了二株高活力拟康氏木霉变异株EA3-867和N2-78。N2-78在适宜的培养条件下，只要培养60小时，用同样方法测定，达到的纤维素酶活力为CMC活力：47单位/毫升，滤纸分解活力：8.2毫克葡萄糖/毫升酶·小时，棉花活力：13.4毫克葡萄糖/毫升酶·24小时，可溶性蛋白：2.4毫克/毫升［11］。
真菌纤维素酶形成的早期研究，指出培养条件的重要性［34］。培养条件下不仅影响酶的数量，也影响到质的变化。Ca+、Mg+和某些微量元素如Co+、Fe+、Mn+、Zn+对于达到最高的酶量是必须的［36，41］，N、P和K都是需要的，最知的N/纤维素之比为1/35，有机氮如尿素、氨基酸、蛋白胨和酪蛋白能增加纤维素的利用速度，同时也增加了酶合成的速度［29］。加表面活性剂如Tween80、蔗糖棕榈酸-酯和油酸钠等显著增加纤维素酶、淀粉酶、嘌呤核苷酶和苯甲酰酶的活性［42］。苯乙醇也有促进作用［43］，可能均与影响膜的透性有关。余永年等曾报道过康氏木霉的生理特性［44］。由于真菌的生长和产酶同时进行，环境因素的影响往往难以分析。我们采用甘油培养基中生长和静止细胞诱导产酶的方法，将生长和产酶分开分析，详细研究了各种条件对生长和产酶的影响［45］。证明了生长需要C源和N、P、Ca、Mg及Zn离子，并将产酶条件归纳为①诱导剂；②菌丝体活跃的代谢；③无机盐如N（尤其是
）、P及Fe、Mn离子；④适宜的温度（30℃左右）、pH（2～5）和通气。O2能刺激产酶，呼吸抑制剂能抑制产酶，因此，纤维素酶形成与呼吸代谢关系甚为密切。木霉菌具有旺盛的糖酵解-三羧循环呼吸途径。同时，产酶与核酸代谢有更直接的关系。纤维素酶的合成包括转录和翻译的过程。
纤维素酶是典型的诱导酶［15，29，33］，即只有外加纤维素底物或其衍生物时，纤维素酶才会形成。但是，对于真正的诱导剂是什么，看法不一。Mandels和Reese发现绿色木霉能在纤维素、纤维二糖、乳糖和葡萄糖中生长产酶，但认为纤维二糖——纤维素的水解产物——是纤维酶真正的诱导剂［33，46］。不过，纤维二糖的诱导活性很低，远远及不上纤维素，在采用较高浓度（1%或更高）及降低代谢速度，或添加表面活性剂时，才能得到较高的酶活性［5，41，47］。曾认为，纤维二糖诱导活性低是由于它是易利用碳源而引起降解物阻遇［41］。又推测，一种三聚糖（纤维二糖的转化产物）可能是纤维素酶的真正诱导剂［41］，但因量太微，难作鉴定。我们用木霉洗涤菌丝体诱导测定的方法，发现纤维二糖不能诱导纤维素酶的形成［45］。另一方面，度剂级葡萄糖中的槐糖杂质（二个葡萄糖分子以β1→2结合形成的双糖）对绿色木霉的纤维素酶有强力的诱导作用［48，49］，萤光假单胞菌同样有效［48］。槐糖对绿色木霉纤维素酶的诱导作用是由于诱使蛋白新合成［56］。我们从槐豆荚中分离得到的结晶槐糖，对拟康氏木霉和绿色木霉等纤维素酶的形成也有强力的诱导作用，在纤维素酶活力，尤其产酶速度上明显超过纤维素［51］。洗涤菌丝体只要同极微量的槐糖（0.34微克/毫升培养基）接触，经过3小时左右的延迟期，纤维素酶各组分（C1、Cx和β-葡萄糖苷酶）便开始合成。槐糖和纤维素诱导的纤维素酶组成和聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱十分类似，推测二者可能能通过共同的机制诱导纤维素酶的形成。又注意到，虽然纤维二糖不能诱导木霉洗涤菌丝体形成纤维素酶，但木霉在0.5%纤维二糖为碳源进行生长培养时，能形成纤维素酶，推测纤维二糖可能在生长过程中转化为槐糖或其类似物。这种转糖苷作用在真菌中十分普遍［46，52，53］。现已证明，大肠杆菌中半乳糖苷酶的真正诱导剂不是乳糖，而是它的转粮苷产物——别乳糖［54］。底物的转化产物作诱导剂的另一例子是木糖对葡萄糖异构酶的诱导作用［55］。我们又根据木霉的纤维素酶有组成酶（微量）和诱导酶二种，将纤维素酶被固体纤维素的诱导过程描述为［51］：木霉菌丝先分泌少量组成性纤维素酶至培养基中，它能“识别”纤维素，将它分解为纤维二糖，后者可能通过某种转化（在胞内或胞外），形成真正的诱导剂——如槐糖或其类似物。从而诱使大量诱导性纤维素酶的形成并分泌到胞外，去分解纤维素作为营养。
真菌纤维素酶的形成一方面受诱导机制的调节，另一方面又受降解物阻遏机制的控制［48，56，57］。我们在拟康氏木霉中同样发现后一种调节机制的存在［45，51］。槐糖对纤维素酶合成的诱导作用能被甘油、葡萄糖以及各种其他糖类、糖磷酯，许多有机酸及NAD、NADP和ATP等所阻止，这种阻遏作用不能被c-AMP克服。(https://www.daowen.com)
诱导和降解物阻遏现象是微生物适应环境、经济而有效地合成酶的一种方式。我们认为，提高纤维素酶产量，从酶形成调节控制的原理来设计，那就是保证菌丝体迅速而健壮地生长的基础上，去阻遏和克服降解物阻遏。木霉液体培养中添加葡萄糖母液使产酶明显加速并增加，就是这个原理运用的具体例证［12，58］。葡萄糖母液是酸水解玉米淀粉生产葡萄糖过程中的废液，含有较高槐糖［53］，并提供前期菌丝迅速生长的碳源（如葡萄糖）。葡萄糖母液为利用高效诱导剂——槐糖提供了廉价的来源。
纤维素酶各组分在细胞中的分布及合成部位的研究报道不多。我们发现拟康氏木霉的C1酶、Cx酶和β-葡萄糖苷酶主要分布在胞内。Suzuki等曾对萤光假单胞菌的纤维素分解变种做过较系统的研究［48，59］，它合成三种纤维素酶（A，B，C）。A和B（分解纤维素）分泌到胞外，C（分解纤维三糖和纤维二糖）在壁内，β-葡萄糖苷酶在细胞内。各组分在细胞内外的合理分布保证了细胞外的纤维素分子逐步从外到里分解为被细胞利用的葡萄糖。由于A和B的比例不同，导致胞外纤维素酶成分的多样化，并在生长过程中发生有规律的变化［60］。作者用酶分子的改造、修饰和蛋白酶的简单作用来解释酶成分的多样化。并证明细胞外纤维素酶是在膜结合的多聚核糖体上形成；而细胞内纤维素酶即纤维二糖酶和β-葡萄糖苷酶既可在膜结合于多聚核糖体上，也可在游离多聚核糖体上合成。
纤维素酶形成的调节制从遗传上加以研究的例子是Myers和Eberhart的工作。他们发现，粗糙链孢霉中凡Cx酶活力高者，纤维二糖酶活力就高，二者是受同一个调节基因cell-1调节。cell-1对ccll-1+是隐性，可能类似于大肠杆菌中β-半乳糖苷酶的调节基因i。酰基-β-葡萄糖苷酶是受另一个gluc-l基因调节［61］。β-葡萄糖苷酶有二种：一种是热不稳定的，存在于菌丝和分生孢子中，它不受gluc-1基因调节；另一种是热稳定的，只存在于分生孢子中，才是受gluc-1基因的调节［62］。我们发现拟康氏木霉野生菌经诱变后得到的高产变异株中，纤维素酶各组分有同步提高的现象，推测可能受同一个调节基因的控制。高产变异株纤维素酶的活力的升高主要是酶蛋白产量的增加，而非酶的结构和性质变化。推测这是调节基因变化而引起，并证明了高产变异株纤维素酶合成的调节机制发生变化：即对诱导剂敏感性增加和对降解物阻遏敏感性减弱导致了酶的高产［63］。
