HMP途径的酶系活力测定
以G-6-P或6-PG为底物，加入NADP和酶液，在340 μm处用分光光度计测得有光密度的增加（见图5），说明有葡萄糖-6-磷酸脱氢酶和6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶的活力。该二酶对NADP是专一的，NAD不能代替（见图6）。
图5 葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的活力测定
反应系统：甘氨酰甘氨酸125 μmoles，pH 7.5，MgCl 210 μmoles，G-6-P 5 μmoles，NADP 0.27 μmole（s纯度78%），酶液0.5 ml。总体积3 ml。空白者缺NADP。反应混合物预先在38℃水浴中预温5分钟，酶液的加入作为反应的开始。用Beckman DU型分光光度计测定340 mμ的光吸收。
图6 油菜荚葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的辅酶专一性
反应系统（见图5）说明：NADP 0.27 μmole，NAD 1 μmole。
为了检查酶液中是否有NADP-NAD转氢酶存在，在葡萄糖-6-磷酸脱氢酶反应系统中，当NADP还原达到饱和时，加入NAD，并不能使340 μm处的吸收峰继续增加，说明不存在NADPH-NAD转氢酶的活力。葡萄糖-6-磷酸脱氢酶和6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶活力能为PCMB所抑制（见表4），与Glock和Mclean（1953）在鼠肝中描述的性质一样，证明有巯基的存在。
表4 PCMB对葡萄糖-6-磷酸脱氢酶和6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶的抑制作用
注：*反应系统见图5说明。
**反应系统同G-6-P脱氢酶，以6-PG（5 μmoles）代替G-6-P。
R-5-P与酶液保温后，根据对于甲基间苯二酚的显色反应，证明有R-5-P的减少（见图7）。这说明有利用和转化R-5-P的酶活力存在。缺NADP和Mg2+，或半胱氨酸时活力有所降低（见表5），因为转酮反应需Mg2+和半胱氨酸。
图7 R-5-P“转化”酶系的活力测定
反应系统：R-5-P 10 μmoles，甘氨酰甘氨酸88 μmoles，pH 7.5，MgCl2 10 μmoles，NADP 0.5 μmole，核黄素0.05 μmole，半胱氨酸1.5 μmole，酶液1.0 ml，总体积2.5 ml。于30℃反应半小时，加等体积20%三氯乙酸终止反应，离心弃去沉淀，清液用甲基间二酚法，根据670 mμm和580 mμm吸收强度的变化，再按实验中求得的计算公式计算核糖和景天庚糖的含量。光密度变化用BeckmanDU型分光光度计或国产71型分光光度计测定。
表5 辅因子对R-5-P“转化”酶系活力的影响
注：*反应条件同图7相同。
由于酶液中有内源果糖，在利用咔唑反应测定戊酮糖时有干扰，故先将酶液对1 000 ml蒸馏水于0℃透析28小时（中途换3次）或用70%饱和度硫酸铵沉淀酶蛋白，再对1 500 ml蒸馏水透析3小时，然后用甲基间苯二酚和咔唑反应，用分光光度计测定R-5-P保温产物的吸收光谱的变化。证明在反应10分钟后，670 mμm的吸收峰下降，540 mμm的吸收峰升高（见图8），前者是核糖的吸收峰，后者是戊酮糖的吸收峰，因而有磷酸戊糖异构酶的活力。
图8 R-5-P保温产物的分析（吸收光谱）
○—○ 0分钟
●—●保温10分钟
反应系统：甘氨酰甘氮酸88 μmoles，R-5-P 10 μmoles，MgCl2 10 μmoles，NADP 0.5 μmole，半胱氨酸1.5 μmoles，核黄素0.05 μmole，酶液1 m（l用70%饱和度硫酸铵提纯过）。总体积2.6 ml。38℃反应10分钟后，加等体积无水酒精杀死。分别用甲基间二酚和咔唑反应测定吸收光谱。
酶液与R-5-P共同保温，测得反应液中景天庚糖和丙糖（见表6），证明有磷酸戊糖异构酶、磷酸戊糖表异构酶和转酮酶的存在。反应液中也有果糖的产生，这可能由于景天庚糖-7-磷酸和磷酸丙糖在转醛酶作用下形成磷酸果糖，或磷酸丙糖通过磷酸丙糖异构酶和醛缩酶的作用再缩合成二磷酸果糖。此外，反应液中还有丙酮酸的产生。可能是R-5-P通过转酮转醛作用产生的磷酸丙糖进一步沿共同的酵解途径降解的结果。由此可见，HMP途径和EMP途径可以通过磷酸果糖和磷酸丙糖相互联系起来。
表6 R-5-P保温产物的分析
注：反应系统：双甘氨肽 725μmoles（pH 7.5），MgCl2 100 μmoles，核黄素0.25 μmole，半胱氨酸7.5 μmoles，NADP 2.7 μmoles，R-5-P 52.8 μmoles，酶液5 m（l含5.3mg蛋白）、总体积12.5 ml，38℃，保温30分钟，加等体积无水酒精杀死测定。
R-5-P保温不同时间的产物动态变化如图9所示，从0分钟到10分钟，R-5-P已显著下降，此时景天庚糖、丙糖、己糖和丙酮酸都有上升，说明R-5-P循戊糖循环而降解，部分磷酸丙糖进行酵解；从10分钟到30分钟，R-5-P继续下降，景天庚糖、己糖和丙酮酸逐渐增加，而丙糖已经开始下降，这表明除了R-5-P继续降解外，形成的丙糖进一步沿酵解途径转化为丙酮酸，也可能通过醛缩酶的作用缩合形成己糖；从30分钟到60分钟，己糖也开始下降；从60分钟至90分钟则所有产物均有不同程度的下降。推测，这些产物进一步沿酵解和三羧酸循环而氧化，提供合成脂肪酸的醋酸来源和ATP的来源。刘承宪等（1964）已证明油菜种子中存在三羧酸循环。
图9 R-5-P转化产物的时间变化
反应条件见图7说明，保温时间：0分、5分、10分、30分、60分和90分。核糖、景天庚糖、己糖、丙糖、丙酮酸测定见正文说明。
己糖；●R-5-P；○景天庚糖；×丙糖；△丙酮酸。
将R-5-P反应产物减压浓缩，用纸谱进行分离，证明保温后FDP的斑点加深，并出现F-6-P和3-PGA的斑点。用醛缩酶作用于反应液，有磷酸丙糖的产生，也说明有FDP的产生。反应液中加入G-6-P脱氢酶和NADP，在340 μm的光吸收增加，证明有G-6-P的产生；若反应液中加NAD的谷胱甘肽、砷酸盐、NaF，则也有340 μm光吸收增加的现象，说明有磷丙糖的形成（见图10）。(https://www.daowen.com)
若再以G-6-P或F-6-P为底物，加上辅因子NADP、Mg2+，与透析过的，或用70%饱和度的硫酸铵提纯过的酶液（以除去对戊糖测定有干扰的物质）共同保温（30℃）10分钟，用甲基间苯二酚反应借助分光光度计测定产物的吸收光谱，证明有标志着核糖产生的670 μm吸收峰的出现（见图11），因而在接近成熟的油菜荚中具有完全的HMP途径的酶系。
图10 R-5-P保温产物对NADP和NAD的反应
注：反应系统A.Tris 105 μmoles，PH 7.4，R-5-P 10 μmoles，核黄素0.05 μmole，半胱氨酸1.5 μmoles，MgCl2 10 μmoles，砷酸钠17 μmoles，NaF 10 μmoles，谷胱甘肽 15 μmoles，NAD 1 μmoles，酶液0.5 ml，空白缺R-5-P，总体积3 ml；B.甘氨酰甘氨酸88 μmoles，PH 7.5，R-5-P 10μmoles，核黄素0.05 μmole，半胱氨酸1.5 μmoles，MgCl2 10 μmoles，NADP 0.5 μmole，酶液0.5 ml，总体积3 ml，空白缺R-5-P。反应温度：38℃，用日立分光光度计测定光密度的变化。
图11 6-PG和F-6-P保温产物的吸收光谱（甲基间二酚反应）
注：●—●F-6-P保温产物；○—○6-PG保温产物
反应系统：甘氨酰甘氨酸125 μmoles，pH 7.5，MgCl2 10 μmoles，NADP 0.5 μmole，6-PG 10 μmole（s或F-6-P 5 μmoles）。酶液0.5 ml，总体积3 ml。于38℃反应10分钟后加3 ml无水酒精杀死。空白预先用无水酒精杀死。反应液用甲基间二酚反应后，用日立分光光度计测吸收光谱。
