槐糖的提取、纯化、结晶和鉴定

参考Clancy的方法［7］，并作了修改。称取750克洗净晾干的槐豆荚（Sophora japonica L.），加2升热蒸馏水浸泡，用组织捣碎机打碎，于沸水浴中搅拌提取20分钟，纱布过滤，二次滤液合并，4 000转/分离心20分钟，取清液薄膜浓缩（16 mmHg，70℃，以下同）至400毫升淡黄色糖浆。滴加4升无水酒精，过夜，以沉淀蛋白和聚多糖。再加500毫升乙醚进一步去多糖，过滤或离心，取清液，薄膜浓缩至250毫升糖浆。加8升H2 SO4，溶液（22.5 mmol/L），于100℃沸水浴中煮沸1小时，以水解槐糖苷。趁热加40毫升Ba（OH）2饱和溶液，以中和至pH 6.0左右。过滤，滤液再薄膜浓缩至400毫升左右，即可作活性炭分离纯化。活性炭型号769，预先于150℃左右加热活化4小时，悬浮于蒸馏水中装柱，装柱量540克（40×6 cm）。糖浆入柱后，先用35升蒸馏水洗脱，以除去单糖，以酚-硫酸法测定，不再有糖，洗下为止。接着，用7%酒精约12升洗脱，流速500毫升/小时，基本上可将槐糖全部洗下。酒精洗脱液薄膜浓缩至干，加80%甲醇结晶，再用冰冷的无水甲醇洗涤结晶多次，抽干，60℃烘干，即得白色槐糖结晶制品，于干燥器中保藏。

图1　槐豆荚提取液活性炭

图2　槐豆荚提取液经活性炭层析分离后各洗脱部分的纸层析图

槐豆荚提取液经活性炭吸附和洗脱后，洗脱液中糖份的分布如图1所示。水洗脱得到峰Ⅰ，以5%、7%、10%、15%和50%酒精洗脱分别得到蜂Ⅱ（分峰尖Ⅱ-Ⅰ和峰肩Ⅱ-2）、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ。其中峰Ⅰ、Ⅱ-1、Ⅱ-2、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ的得糖量分别为105、2.46、0.91、0.42，0.36和0.27克。峰Ⅵ中混有大量被洗下的色素。根据预备试验表明，769活性炭上用水洗脱下来的为单糖，5%～10%酒精洗脱部分主要为双糖，10%以上酒精洗脱下的为叁糖和寡糖。将峰Ⅰ-Ⅵ分别浓缩，进行纸层析分离，用苯胺-二苯胺试剂显色，并与标准糖进行比较（见图2）。可看到，水洗脱液中主要含单糖，5%和7%酒精洗脱液中含有大量的未知双糖（位置在蔗糖和纤维二糖之间，RG约0.33）。随着酒精洗脱浓度的增加，未知双糖的含量逐渐减少，而未知寡糖的含量逐渐增多。未知双糖用苯胺-二苯胺试剂显色时，在纸谱上显出特殊的棕黄色，用AgNO3试剂显色时呈咖啡色，而用三苯基四唑化氯试剂显色时，颜色几乎看不出；而且峰Ⅱ和峰Ⅲ的糖只能用酚-硫酸法检出，与DNS试剂却不起反应，这说明，此未知双糖是非还原糖。将峰Ⅱ和峰Ⅲ洗脱液合并，浓缩，在80%甲酵中能析出白色针状结晶，得率为0.24%（对槐豆荚鲜重），用显微熔点测定仪测得晶体熔点为192～195℃，而且，对木霉洗涤菌丝体的纤维素酶形成有强烈的诱导作用（待发表）。总之，从以上未知双糖在活性炭上的吸附洗脱行为，纸层析位置和显色情况、结晶的颜色、形状和熔点，以及诱导活性等等，与文献上记载的槐糖特性相符，说明从槐豆荚中提取分离到的双糖结晶就是2-O-β-D葡萄吡喃糖基-D-葡萄糖，即槐糖。