5.酶活力测定

5.酶活力测定

1）酶液制备

（1）胞外酶：用3号砂蕊漏斗抽滤培养液，抽滤液为胞外酶。

（2）胞内酶：未滤去的菌丝体用100毫升磷酸盐缓冲液（0.01 mol/L，pH 5）洗涤，抽干，再悬浮在15毫升同样的缓冲液中，用超声波（M.S.E）破碎，20 KC，破碎5分钟，得到胞内酶。

2）酶活力测定方法

（1）CMC酶活（Cx）：0.5毫升适当稀释的酶液，加2.0毫升pH 5的0.625%CMC溶液（1000毫升1%CMC，加200毫升0.05 mol/L柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液和400毫升水配成），于40℃水浴中保温半小时，加2.5毫升DNS试剂［8］终止反应，于沸水浴中煮沸5分钟，在540毫微米波长比色，要求光密度读数在0.5毫克葡萄糖左右。按Mandels早期定单位的方法［2］，规定在上述反应条件下，每产生0.5毫克还原糖，为1个Cx活力单位[2]。

（2）滤纸酶活（F.D）：50毫升容量瓶内投入二张Whatman No.1滤纸（1×1厘米2），加4毫升酶液和1毫升醋酸缓冲液（0.1 mol/L，pH 4.6），于瓦氏呼吸器振荡机上40℃恒温振荡（100次/分，振幅5厘米）观察滤纸全部崩溃成粉状所需的时间（分钟），依下面公式计算活力单位（u）：

活力单位/毫升=250/崩溃时间（分钟）(https://www.daowen.com)

（3）纤维二糖酶：0.5毫升酶液，加2毫升纤维二糖溶液（10-3 mol/L，溶于0.02 mol/L醋酸缓冲液中，pH 5.0），于40℃水浴中保温2小时，用DNS法测定还原糖的增加。单位定法同Cx。

（4）淀粉酶：0.5毫升酶液，加2毫升1%淀粉溶液（溶于0.02 mol/L，pH 4.8醋酸缓冲液中），于30℃保温半小时，用DNS法测定形成的还原糖。单位定法同Cx。

（5）果胶酶：2毫升适当稀释的酶液，加0.5毫升多聚半乳糖醛酸溶液（0.5%，溶于0.1 mol/L，pH 4.5醋酸缓冲液中），30℃反应半小时，用DNS法测定形成的半乳糖醛酸，每产生0.5毫克半乳糖醛酸为1个单位。

（6）半纤维素酶［12］：以玉米芯提取的半纤维素为底物，用甲基间苯二酚法测定酶解形成的木糖。在规定条件下形成0.5毫克木糖为1个单位。

（7）蛋白酶［12］：以酪蛋白为底物，测定酶解产生的酪氨酸，规定形成1个微克的酪氨酸为1个单位。