三、免疫酶技术
利用酶标记Ag或Ab后不改变Ag、Ab反应特异性，同时又不影响酶的活性的原理，结合在Ag、Ab上的酶催化底物，生成有色产物；根据产物颜色深浅推测出待测物中相应物质（Ag、Ab）有无及含量多少。该法优点是敏感、安全、稳定，易观察结果。常用的酶有辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）和碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）等。常用的方法有酶免疫组织化学染色技术（免疫组化法）和酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）。其中，ELISA是酶免疫测定技术中应用最广的技术。其基本方法是将已知的抗原或抗体吸附在固相载体（聚苯乙烯微量反应板）表面，使酶标记的抗原抗体反应在固相表面进行，用洗涤法将液相中的游离成分洗除。常用的ELISA有双抗体夹心法和间接法，前者用于检测大分子抗原，后者用于测定特异性抗体。
（一）双抗体夹心法
双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法，在临床检验中，此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原，如HBsAg、HBeAg、AFP、HCG等。只要获得针对受检抗原的特异性抗体，就可用于包被固相载体和制备酶结合物而建立此法（图19-10）。双抗体夹心法适用于测定二价或二价以上的大分子抗原，但不适用于测定半抗原及小分子单价抗原，因其不能形成两位点夹心。
图19-10 双抗体夹心法（ELISA）检测抗原(https://www.daowen.com)
（二）间接法
此测定方法与直接法类似，差别在于一级抗体没有酶标记，改用酶标记的二级抗体去辨识一级抗体来测定抗原量（图19-11）。
（三）双抗原夹心法测抗体
图19-11 间接法（ELISA）检测相应抗体
反应模式与双抗体夹心法类似。用特异性抗原进行包被和制备酶结合物，以检测相应的抗体。与间接法测抗体的不同之处为以酶标抗原代替酶标抗抗体。此法中受检标本不需稀释，可直接用于测定，因此其敏感度相对高于间接法。乙肝标志物中抗HBs的检测常采用本法。本法关键在于酶标抗原的制备，应根据抗原结构的不同，寻找合适的标记方法。
（四）应用亲和素和生物素的ELISA（BAS-ELISA）
生物素-亲和素系统（biotin-avidin system，BAS）是一种新型生物反应放大系统。BASELISA是在常规ELISA原理的基础上，结合生物素（B）与亲和素（A）间的高度放大作用，而建立的一种检测系统。生物素易与蛋白质（如抗体等）以共价键结合，这样结合了酶的亲和素分子与结合有特异性抗体的生物素分子产生反应，既起到了多级放大作用，又由于酶在遇到相应底物时的催化作用而呈色，达到检测未知抗原（或抗体）分子的目的。
（五）ELISA试验的影响因素
（1）固相载体：常用聚苯乙烯。其特点是吸附Ag或Ab的能力强，一旦吸附后，不能被洗脱，而且形状多——试管、珠、微孔板（酶标板），分软、硬板（最常用）。通常为一次性使用，不可回收。用酶标板时要求吸附性能好、空白值低、透明度高、板批间和孔间性能相近。
（2）抗原、抗体：包被的Ag、Ab均需纯化，所用Ab应效价高、亲和力强。
（3）实验条件：包被、Ag-Ab反应、洗涤、酶促反应等条件均需优化。