二、荧光免疫技术
荧光免疫技术是将抗原抗体反应与荧光技术相结合而建立的一种免疫标记技术，具有高度特异性、敏感性和直观性。荧光免疫技术是最早出现的免疫标记技术。1941年，美国科学家Coons等首次报道采用异硫氰酸荧光素标记抗肺炎链球菌抗体，在荧光显微镜下检测小鼠组织切片中肺炎链球菌荚膜多糖抗原。1958年，Riggs等合成性能更加优良的异硫氰酸荧光素，并由Marshall等对荧光抗体的标记方法进行了改进。1960年，Glodstein通过改进纯化荧光抗体的方法，较好地解决了非特异性荧光染色的问题，从而使荧光免疫技术逐渐推广应用。
经典的荧光免疫技术是以荧光素标记抗体对抗原进行定位染色，并借助荧光显微镜观察标本片上荧光染色形态，从而判断是否存在待测抗原，这种技术被称为荧光抗体技术（fluorescence antibody technique，FAT）。20世纪70年代以来，荧光抗体技术不断完善，不仅可以检测抗原，亦可用于检测抗体，并且，从原来仅限于检测固定标本扩展到进行活细胞分类检测及多种细胞成分分析。在此基础上进一步发展出荧光免疫分析技术，可对液体中的抗原、抗体进行自动化定量检测，极大地拓展了荧光免疫技术的应用范围。
（一）荧光物质
许多物质都可产生荧光现象，但并非都可用作荧光物质。只有那些能产生明显荧光的有机化合物才能作为荧光色素。常用的荧光色素如下。
（1）异硫氰酸荧光素（FITC）：黄色或橙黄色结晶粉末，易溶于水或酒精等溶剂。分子质量为389.4 Da，最大吸收光波长为490～495 nm，最大发射光波长为520～530 nm，可呈现明亮的黄绿色荧光。FITC有两种同分异构体，其中异构体Ⅰ型在荧光效率、稳定性与蛋白质的结合力等方面都更具优势，在冷暗干燥处可保存数年。FITC是应用最广泛的荧光素，其主要优点在于人眼对黄绿色较为敏感，并且由于标本中的绿色荧光较少，荧光染色时背景干扰小。
（2）四乙基罗丹明（RB200）：橘红色粉末，不溶于水，易溶于酒精和丙酮，性质稳定，可长期保存。最大吸收光波长为570 nm，最大发射光波长为595～600 nm，呈橘红色荧光。可与FITC的绿色荧光形成鲜明的对比，常用于双重标记或对比染色，但RB 200荧光效率较低。
（3）藻红蛋白（PE）：从部分藻类植物中可分离出一类与光合作用有关的蛋白，称为藻蛋白。PE是从红藻中分离纯化的一种藻蛋白，分子质量为240 kD，其最大吸收光波长为565 nm，最大发射光波长为578 nm。由于它在488 nm处的光吸收率为565 nm处的75%，因此PE与FITC可用于双标记免疫荧光染色，并且可以共用488 nm波长的激发光。与传统化学荧光色素相比，PE具有吸收光谱较宽、荧光量子产率高、荧光强而稳定、灵敏度高、不易淬灭等特点，目前已得到广泛应用。
（4）其他荧光物质：①镧系螯合物：某些3价稀土镧系元素如铕（Eu3+）、铽（Tb3+）、铈（Ce3+）等螯合物经激发后也可发射特征性荧光，其中以Eu3+应用最广。Eu3+螯合物的激发光波长范围宽，发射光波长范围窄，荧光衰变时间长，较适合用于时间分辨荧光免疫测定。②酶作用后产生的荧光物质（荧光底物）：某些化合物本身无荧光，但经酶作用后所形成的物质具有强烈的荧光。例如，4-甲基伞酮-β-D半乳糖苷，受β-半乳糖苷酶的作用后分解成4-甲基伞酮，后者可发出荧光，激发光波长为360 nm，发射光波长为450 nm。其他如碱性磷酸酶的底物（4-甲基伞酮磷酸盐）和辣根过氧化物酶的底物（对羟基苯乙酸）等，都具有荧光底物的性质，可以用于荧光酶免疫分析。
（二）荧光抗体染色与结果判断
首先在已固定的标本片上滴加适当稀释的荧光抗体，置湿盒内，25～37℃、30 min温育或4 ℃过夜，再用磷酸盐缓冲溶液（PBS）充分洗涤；最后干燥、镜检。根据染色方法的不同，可将荧光显微镜技术分为直接法和间接法。
1.直接法 用荧光素标记抗体直接与标本中的相应抗原反应，洗涤、干燥后在荧光显微镜下观察特异性荧光，以检测未知抗原（图19-8）。该方法操作简便，快速，特异性强，但敏感性不及间接法，并且一种荧光抗体只能检测一种抗原。
图19-8 直接荧光抗体染色法原理示意图
2.间接法 用特异性抗体与标本中相应抗原反应，再用荧光素标记的第二抗体（抗抗体）与免疫复合物中第一抗体结合，洗涤、干燥后在荧光显微镜下观察特异性荧光，检测未知抗原或抗体（图19-9）。该方法比直接法敏感性提高5～10倍，且一种荧光二抗可检测多种抗原或抗体，缺点是容易产生非特异性荧光。
图19-9 间接荧光抗体染色法原理示意图
3.双标记法 抗原抗体反应的原理与直接法相同。采用两种荧光素（FITC、RB200）分别标记两种不同的特异性抗体，加在同一标本上进行反应，洗涤、干燥后在荧光显微镜下观察特异性荧光，若有两种对应的抗原存在，可见到两种颜色的荧光。该法用于检测同一标本中的两种抗原。
4.荧光抗体染色结果判断 应严格掌握荧光抗体染色后的结果判断，要准确判读阳性和阴性结果，并排除假阳性和假阴性结果。在每次实验时均需设立严格的实验对照（阳性和阴性对照），并正确区分特异性染色和非特异性染色。阳性细胞的显色分布（膜表面型、胞质型和胞核型）和显色深浅可作为抗原定性、定位和定量的依据。标本的特异性荧光强度一般用“+”或“-”表示。“-”为无或仅见极微弱荧光，“+”为荧光较弱但清晰可见，“++”为明亮的荧光；“+++”为耀眼的强荧光。临床上通常根据特异性荧光强度达“+”以上判定为阳性，而对照光应呈“-”或“±”。在检测抗体时，根据出现“+”的血清最高稀释度判定待测抗体的效价。
（三）荧光免疫测定的应用
目前，时间分辨荧光免疫测定、荧光偏振免疫测定和荧光酶免疫测定都有全自动化分析仪器，这些仪器具有试剂和样本条码识别系统，能自动加样、温育、洗涤、分离、测定荧光强度、处理数据和报告结果。时间分辨荧光免疫测定的应用范围十分广泛，主要包括蛋白质、激素（肽类激素、甲状腺激素、类固醇激素等）、药物、肿瘤标志物、病原体抗原/抗体等。荧光偏振免疫测定特别适用于血清或尿液中小分子抗原物质的测定，目前已有数十种治疗药物和成瘾药物、维生素、激素可用荧光偏振免疫测定法进行定量检测。荧光酶免疫测定可用于多种抗原抗体的检测，如细菌及毒素抗原、病毒抗体、激素、肿瘤标志物、过敏原、心肌损伤指标和凝血因子等。