四、发光免疫分析

发光免疫分析（luminescence immunoassay，LIA）是用化学与生物发光系统取代放射性元素或酶作标记物的免疫分析。其检测原理同放射免疫分析和酶免疫分析。它既具有免疫反应的特异性，又有发光反应的高灵敏性，是继传统三大标记技术（放射性核素标记、荧光标记和酶标记）之后又一新的标记免疫技术。此法具有灵敏度高、特异性强、标记物稳定、无放射性危害等优点，而且只需微量标本。根据发光反应、标记物和标记方法的不同，可分为以下几种。

（一）化学发光免疫分析（CLIA）

化学发光免疫分析是将具有高灵敏度的化学发光测定技术与高特异性的免疫反应相结合，用于各种抗原、半抗原、抗体、激素、酶、脂肪酸、维生素和药物等的检测分析技术。化学发光免疫分析包含两个部分，即免疫反应系统和化学发光分析系统。化学发光分析系统利用化学发光物质经催化剂的催化和氧化剂的氧化，形成一个激发态的中间体，当这种激发态中间体回到稳定的基态时，同时发射出光子（hM），利用发光信号测量仪器测量光量子产额。免疫反应系统将发光物质（在反应剂激发下生成激发态中间体）直接标记在抗原（化学发光免疫分析）或抗体（免疫化学发光分析）上。

（二）化学发光酶免疫测定（chemiluminescence enzyme immunoassay）

碱性磷酸酶标记的抗体，经过夹心法免疫反应（和IRMA相似），复合物带有酶标记，加入底物，酶促反应使底物断裂，产生化学发光。底物为金刚烷，在碱性磷酸酶作用下脱去磷酸根形成中间体，中间体自行断裂，同时发射光子。由于酶促反应要持续一段时间，发射光子的过程较化学发光免疫分析长、稳定，因此可靠性高。如：酶是用辣根过氧化物酶，常用底物是鲁米诺或其衍生物。

（三）生物发光免疫分析(https://www.daowen.com)

用生物发光物（如萤火虫荧光素酶或细菌荧光素酶）或用辅助因子（三磷酸腺苷等）标记抗原，使其直接或间接地参与发光反应。

（四）免疫胶体金技术（immune colloidal gold technique，ICGT）

该法采用胶体金作为标记物。胶体金又称金溶胶，是金盐（氯金酸）被还原（还原剂：柠檬酸钠）成原子金后的金颗粒悬液；颗粒稳定均匀，分散悬浮，颜色与颗粒大小有关。胶体金在弱碱环境下带负电荷，可与蛋白质分子的正电荷基团形成牢固的结合；由于这种结合是静电结合，所以不影响蛋白质的生物特性。胶体金除了与蛋白质结合以外，还可以与许多其他生物大分子结合，如SPA、PHA（植物血凝素）、ConA（刀豆蛋白A）等。胶体金的一些物理性状，如高电子密度、颗粒大小、形状及颜色反应，加上结合物的免疫和生物学特性，使胶体金广泛地被应用于免疫学、组织学、病理学和细胞生物学等领域。临床HCG检测是免疫胶体金技术应用的典型例子：该检测以硝酸纤维素膜为载体，利用微孔膜毛细管作用，使膜一端的液体慢慢向另一端渗移，犹如层析。对于HCG阳性标本，尿中HCG与金标记的鼠抗人HCG单抗结合形成免疫复合物，随层析作用向上移动，至检测线与鼠抗人HCG抗体结合而聚集显色，在检测线，未结合的金标记鼠抗人HCG单抗（IgG）随着尿液上行，到达质控线后与羊抗鼠IgG（二抗）结合而显色，作为质控对照；对于HCG阴性标本，尿中无HCG与金标记的鼠抗人HCG单抗结合形成免疫复合物，随层析作用向上移动，至检测线与鼠抗人HCG抗体不结合而不显色，在检测线未结合的金标记鼠抗人HCG单抗（IgG）随着尿液上行，到达质控线与羊抗鼠IgG（二抗）结合而显色，作为质控对照；若试纸条无效，金标记鼠抗人IgG单抗随层析作用向上移动，到达质控线，无羊抗鼠IgG（二抗）或破坏失效，不结合而不显色，作为质控对照。

（五）免疫印迹法（immunoblotting，IBT/Western blotting，WB）

免疫印迹法是一种将高分辨率凝胶电泳和免疫化学分析技术相结合的杂交技术。免疫印迹法具有分析容量大、敏感度高、特异性强等优点，是检测蛋白质特性、表达与分布的一种最常用的方法，如组织抗原的定性定量检测、多肽分子的质量测定及病毒的抗体或抗原检测等。免疫印迹法分三个阶段进行：第一阶段为SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），将抗原等蛋白样品根据分子量大小进行分离。第二阶段为电转移，将在凝胶中已经分离的条带转移至硝酸纤维素膜上。第三阶段为酶免定位，将印有蛋白质条带的硝酸纤维素膜（相当于包被了抗原的固相载体）依次与特异性抗体和酶标第二抗体作用后，加入能形成不溶性显色物的酶反应底物，使区带染色。