抗原、抗体的检测
抗原与抗体在体外可以特异性结合，在一定条件下出现肉眼可见的现象，也可借助仪器进行定性及定量分析。因试验用的抗体来自血清，因此抗原-抗体反应也称血清学试验。
（一）抗原-抗体反应的特点
1.特异性 一种抗原一般仅能与由它刺激所产生的抗体结合，这种抗原、抗体结合反应的专一性即特异性。抗原-抗体反应的理论基础就是特异性，故可用已知抗体检测未知抗原，或用已知抗原检测未知抗体。
2.比例性 抗原、抗体数量比与可见反应的出现有关，二者只有在比例适合的时候，才能出现最易观察到的凝集或沉淀现象。抗原或抗体过多，都会影响结果的观察。
3.可逆性 抗原与抗体的结合为分子表面的非共价结合，结合相对稳定，但在某些情况下（如高盐、低pH值等）也可解离，解离后的抗原或抗体分子仍保持原有的理化性质及生物学活性。
4.阶段性 抗原-抗体反应分为两个阶段，第一阶段为特异性结合，很快即可完成，第二阶段是在液相中出现可见现象，根据反应时参与的因素（如电解质、酸碱度、温度等），可为数分钟或数日。
（二）抗原-抗体反应的类型
1.凝集反应 细菌、红细胞等颗粒性抗原与相应抗体在一定的条件下（如电解质、pH、温度、抗原和抗体比例等）结合后形成肉眼可见的凝集现象，此类反应称为凝集反应。
（1）直接凝集 将细菌或红细胞与相应抗体直接反应，出现细菌凝集或红细胞凝集现象（图34-1）。试验中通常将颗粒性抗原称为凝集原，将抗体称凝集素或抗血清。直接凝集包括玻片法和试管法。①玻片法：定性试验，简便快速，多采用已知抗体检测未知抗原，常用于细菌鉴定和ABO血型鉴定。②试管法：半定量试验，是在试管中倍比稀释待检血清，加入已知颗粒性抗原，用于抗体的半定量检测，如诊断伤寒的肥达试验、诊断立克次体病的外斐试验。
（2）间接凝集 将可溶性抗原包被在与免疫无关的载体颗粒表面，再与相应抗体反应，出现肉眼可见的颗粒物凝集现象，称正向间接凝集试验。如果把抗体包被在与免疫无关的载体颗粒表面检测相应的抗原则称为反向间接凝集试验。常用的载体为人O型血红细胞、聚苯乙烯乳胶颗粒等（图34-2）。在检测标本中的抗原时，先将标本与已知的抗体混合，然后再加入事先已吸附已知抗原的载体颗粒，如果标本中有被测抗原，则已知抗体先与标本中的抗原结合，结果第二步因没有抗体与载体颗粒表面的抗原结合而不出现凝集现象为阳性，此试验称间接凝集抑制试验。
图34-1 直接凝集反应示意图
图34-2 间接凝集反应示意图(https://www.daowen.com)
间接凝集反应具有简便、快速、灵敏度高等优点，因此在临床上得到广泛应用，例如妊娠胶乳试验以及类风湿因子、乙型肝炎病毒表面抗原、梅毒反应素的检测等，均可采用间接凝集试验。
2.沉淀反应 可溶性抗原（如血清蛋白质、细胞裂解液或组织浸液等）与相应抗体结合后在一定条件下出现肉眼可见的沉淀物，称为沉淀反应。此试验中的抗原称为沉淀原，抗体称为沉淀素。主要包括琼脂扩散试验与免疫比浊技术。
（1）琼脂扩散试验 在半固体琼脂凝胶中进行的沉淀反应称琼脂扩散试验。①单向免疫扩散：将已知定量抗体混于琼脂凝胶中制成琼脂板，在适当位置打孔后将抗原加人孔中扩散。抗原在扩散过程中与凝胶中的抗体相遇，形成以抗原孔为中心的沉淀环，环的直径与抗原含量呈正相关。取已知定量抗原绘制标准曲线，可根据所形成沉淀环的直径，从标准曲线中查出待检标本的抗原含量。本法常用于定量测定血清IgG、IgM、IgA、C3及其他血清蛋白的含量。②双向免疫扩散：将抗原与抗体分别加于琼脂凝胶的小孔中，二者自由向四周扩散，在相遇处形成沉淀线。一对相应的抗原抗体只形成一条沉淀线，多种抗原、抗体系统可形成多条沉淀线。本法常用于抗原或抗体的定性检测和两种抗原的相关性分析（图34-3）。③火箭电泳：将单向琼脂反应放在电场中进行，电泳时将抗原放在负极使其向正极定向泳动，在泳动过程中与琼脂中的已知抗体结合形成锥形沉淀峰，形似火箭，故称火箭电泳。沉淀峰的高度与抗原浓度成正比。火箭电泳需时较短，应用范围与单项免疫扩散相同。④对流免疫电泳：将双向免疫扩散的琼脂板，打成平行的两排孔，一侧孔中加抗原，另一侧孔中加抗体，抗原置负极侧，抗体置正极侧，在电泳仪上电泳，大大缩短反应时间。如有相应抗原、抗体，在1 h左右即可看到两孔之中有沉淀线出现，其应用范围与双向免疫扩散相同。
（2）免疫比浊技术 在一定的抗体浓度下，加一定体积的样品，经过一段时间，用光散射浊度计测定反应液体的浓度，来推算样品中的抗原含量。本法灵敏、快速、简便，可取代单向琼脂扩散法测定免疫球蛋白的含量。
图34-3 双向免疫琼脂扩散试验结果示意图
3.免疫标记技术 免疫标记技术是用荧光素、酶、胶体金及放射性核素等标记物标记抗体或抗原所进行的抗原-抗体反应。免疫标记技术可增强抗原-抗体反应的灵敏度及精确度，既可对样品做定性、定量检测，也可进行定位分析，是目前应用最为广泛的免疫学检测技术。
（1）免疫荧光技术 此法是用荧光素标记抗体或抗原，再与待检标本中抗原或抗体反应后置荧光显微镜下观察，抗原-抗体复合物散发荧光，借此对标本中的抗原或抗体进行鉴定或定位分析。常用的荧光素有异硫氰酸荧光素和藻红蛋白等，免疫荧光技术包括直接法及间接法。
（2）酶免疫测定 此法将抗原-抗体反应的特异性与酶催化作用的高效性相结合，即以酶标记的抗原或抗体作为主要试剂，检测样本中相应的抗体或抗原，通过酶作用于底物后的显色反应判定结果。也可用酶标测定仪测定光密度（OD）值以反映抗原或抗体含量，其特点为方法简单、灵敏度高、特异性好，酶标记物有效期长、试剂价格低。灵敏度可达每毫升ng甚至pg水平。常用于标记的酶有辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等。常用的方法有酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）。
ELISA基本方法如下：将已知抗原或抗体吸附在固相载体（聚苯乙烯微量反应板）表面，使抗原-抗体反应在固相表面进行，用洗涤法将固相上的抗原-抗体复合物与液相中的游离成分分开，再加入底物显色。根据所检测成分不同，采用不同的操作方法，如夹心法、间接法、竞争法、捕获法等。下面简介两种常用的ELISA方法：①双抗体夹心法：用于检查特异性抗原。将已知抗体包被固相载体，加入待检标本，标本中若含有抗原即与固相表面的抗体结合，洗涤去除未结合成分，加入酶标记抗体，作用后洗去未结合的酶标记抗体，加入底物，底物受酶催化而显色（图34-4）。②间接法：用于检测特异性抗体。将已知抗原包被固相载体，加入待检标本，洗涤后再加入酶标记的抗体，洗涤后加底物，观察显色反应。
图34-4 ELISA双抗体夹心法示意图
（3）免疫胶体金技术 免疫胶体金技术是以胶体金作为标记物应用于抗原-抗体反应的一种新型免疫技术。目前已有数十种检测试剂应用于临床。在免疫检测中，金标记常与膜载体配合，形成特定的测定模式，典型的如斑点免疫渗滤试验及斑点免疫层析试验等，是目前临床上广泛使用的既简便、快速，又灵敏度高、精确度好的一种方法。
（4）放射免疫测定法 用放射性核素标记抗原或抗体进行免疫学检测。它将放射性核素具有的高灵敏度和抗原-抗体反应的特异性相结合，使检测的灵敏度达pg水平。该法常用于测定微量物质，如胰岛素、生长激素、甲状腺素、孕酮等激素，以及吗啡、地高辛等药物。但此技术存在一定的放射性污染。