蛋白质的理化性质

四、蛋白质的理化性质

蛋白质既然由氨基酸组成，其理化性质必然与氨基酸相同或相关，例如，两性电离及等电点（pI）、呈色反应等。但蛋白质又是生物大分子化合物，还具有胶体性质、沉淀、变性和凝固等特点。

（一）蛋白质的两性电离

蛋白质分子除两端的氨基和羧基可解离外，侧链中某些基团，如谷氨酸、天冬氨酸残基中的γ和β-羧基，赖氨酸残基中的ε-氨基，精氨酸残基的胍基和组氨酸的咪唑基，在一定的溶液pH条件下都可解离成带负电荷或正电荷的基团。当蛋白质溶液处于某一pH时，蛋白质解离成正、负离子的趋势相等，即成为兼性离子，净电荷为零，此时溶液的pH称为蛋白质的等电点（pI）。蛋白质溶液的pH大于等电点时，该蛋白质颗粒带负电荷，反之则带正电荷。

体内各种蛋白质的等电点不同，但大多数接近于pH 5.0。所以在人体体液pH 7.4的环境下，大多数蛋白质解离成阴离子。少数蛋白质含碱性氨基酸较多，其等电点偏于碱性，被称为碱性蛋白质，如鱼精蛋白、组蛋白等。也有少量蛋白质含酸性氨基酸较多，其等电点偏于酸性，被称为酸性蛋白质，如胃蛋白酶和丝蛋白等。

（二）蛋白质的胶体性质

蛋白质是生物大分子，分子质量一般都在104～106Da或更高，更有甚者如烟草花叶病毒蛋白质的分子质量高达40×106Da。由于分子质量大，其颗粒直径约1～100nm，属胶体颗粒范围，所以蛋白质是胶体物质。

蛋白质是亲水胶体。构成亲水胶体的两个因素是蛋白质颗粒表面的水膜和同性电荷。蛋白质颗粒表面有很多亲水基团，如氨基、羧基、疏基、羟基和酰氨基等。这些亲水基团与水结合，从而使蛋白质的颗粒表面形成水膜。由于水膜的相隔作用，阻止了蛋白质颗粒之间的聚集而不易沉淀。

蛋白质分子在大于等电点的溶液中，颗粒表面以负电荷为主；在小于等电点时，蛋白质颗粒表面以正电荷为主。这种同性电荷的相斥作用，也会使溶液中的蛋白质颗粒不易聚集而沉淀。

蛋白质的亲水胶体性质具有重要的生理意义。每克蛋白质含0.30～0.55g水。血液中的蛋白质通过与水的结合，可维持有效的血容量。若血液中蛋白质含量减少，就会影响血管内外水的交换，从而引起水肿。细胞内原生质中的代谢活动需要水的参与，水既是良好的溶剂，也有利于反应过程中吸收热量。而这些都与原生质中的蛋白质的亲水性有关。

蛋白质的亲水胶体性质也是蛋白质分离、纯化方法的基础。要想使蛋白质自溶液中分离出来，只需要破坏蛋白质颗粒表面的水膜和同性电荷即可。又由于蛋白质的颗粒直径较大，不能透过半透膜，据此，可以用透析的方法除去蛋白质提取物中的无机离子等小分子杂质。

（三）蛋白质的电泳

带电的蛋白质胶粒，在电场中向与自身所带电荷相反的电极泳动的现象，称为蛋白质的电泳。电泳的速度取决于蛋白质颗粒大小和所带电荷的多少。在一定的pH条件下，各蛋白质所带电量不同，在电场中就会以不同速度泳动，根据这一原理可将混合蛋白质予以分离。

根据支撑物的不同，有薄膜电泳、凝胶电泳等。薄膜电泳是将蛋白质溶液点样于薄膜上，薄膜两端分别加正负电极，此时带正电荷的蛋白质向负极泳动；带负电荷的向正极泳动；带电多，分子量小的蛋白质泳动速率快；带电少，分子量大的则泳动慢，于是蛋白质被分离。凝胶电泳的支撑物为琼脂糖、淀粉或聚丙烯酰胺凝胶。凝胶置于玻璃板上或玻璃管中，两端加上正负电极，蛋白质即在凝胶中泳动。电泳结束后，用蛋白质显色剂显色，即可看到一条条已被分离的蛋白质色带。

（四）蛋白质的沉淀反应

所谓蛋白质的沉淀就是蛋白质分子聚集而从溶液中析出的现象。蛋白质的沉淀反应有重要的实用价值，沉淀方法有如下几种。

1.中性盐沉淀反应

将大量高浓度的中性盐加入蛋白质溶液中，使蛋白质从溶液中沉淀析出的现象称为盐析。常用的中性盐有NaCl、NH4Cl、MgCl2、（NH4）2SO4等。中性盐在水中溶解度大，能和蛋白质颗粒争夺与水的结合，从而破坏水膜；其次是这些中性盐在水中解离作用强，能中和蛋白质分子表面的电荷。蛋白质颗粒在水中赖以稳定的两个因素均被破坏，所以从溶液中沉淀析出。由于不触及蛋白质分子的内部结构，所以用此方法沉淀的蛋白质不变性。因此本法是分离制备酶、激素等具有生物活性的蛋白类物质常用的方法。

在用中性盐沉淀蛋白质时须注意如下几条：

（1）低浓度的中性盐可以增加蛋白质在水中的溶解度，这种现象称为盐溶。

（2）同样浓度的情况下，二价离子中性盐比一价离子中性盐的沉淀效果好。其中以硫酸铵效果最佳，因为它在水中的溶解度很高，而溶解度的温度系数很低。

（3）不同的蛋白质因其分子大小、电荷性质的不同，盐析时所需盐的浓度各异。混合蛋白质溶液可用不同的盐浓度使其分别沉淀，这种方法称为分级沉淀。(https://www.daowen.com)

2.有机溶剂沉淀反应

在蛋白质溶液中加入一定量的能与水互溶的有机溶剂，如乙醇、甲醇、丙酮、甲醛等，能使蛋白质失去水膜，致使蛋白质颗粒聚集而沉淀。使用有机溶剂沉淀蛋白质时须注意如下几条：

（1）在室温下，这些有机溶剂可以造成被沉淀的蛋白质变性。如果预先将有机溶剂冷却到-60～-40℃，然后在不断搅拌下将其加入，以防止局部浓度过高，则可以在很大程度上解决被沉淀蛋白质的变性问题。

（2）在等电点时加入有机溶剂，沉淀效果更好。

（3）在一定温度、pH和离子强度条件下，引起蛋白质沉淀的有机溶剂的浓度不同，因此利用不同浓度的有机溶剂，可以对蛋白质进行分级分离。

3.重金属盐沉淀蛋白质

蛋白质在带负电荷时能与重金属离子如Cu2+、Hg2+、Pb2+、Ag+结合成不溶性的蛋白盐而变性沉淀。

4.生物碱试剂和某些酸类沉淀法

生物碱试剂是指能引起生物碱沉淀的试剂，如鞣酸、磷钨酸、磷铂酸、苦味酸和碘化钾等。蛋白质在带正电荷时，可与上述物质结合形成不溶性沉淀。

5.加热沉淀蛋白质

加热可使蛋白质变性，也可使变性的蛋白质沉淀，这主要取决于溶液的pH。蛋白质在等电点时最易沉淀，若在偏酸或者偏碱时，虽变性也不易发生沉淀。

（五）蛋白质的呈色反应

蛋白质多肽链上的肽键和一些侧链基团能与某些试剂结合而显示出特有的颜色，利用蛋白质的颜色反应可以对蛋白质进行定性、定量分析。由于蛋白质是由基本单位——氨基酸组成的，所以蛋白质也具有氨基酸所具有的某些颜色反应。因此，在利用颜色反应进行蛋白质的鉴定时，一定要结合蛋白质的其他特性全面加以考虑，切不可以任何单一的反应来确证蛋白质的存在。

1.茚三酮反应

在pH5～7时，蛋白质与茚三酮试剂加热可产生蓝紫色。此反应是试剂与蛋白质中的氨基的反应。

2.双缩脲反应

双缩脲是2分子的脲（尿素）经加热脱氨缩合生成的产物（图5-8）。2分子双缩脲在碱性溶液中能与硫酸铜试剂中的Cu2+结合成粉红色的复合物，这一呈色反应称为双缩脲反应。

一切蛋白质和两个肽键以上的多肽化合物都能进行双缩脲反应，且肽键越多颜色越深。故此反应可用于蛋白质的定性定量分析，还可用于检测蛋白质的水解程度。

3.酚试剂反应蛋白质分子酪氨酸、色氨酸的酚基在碱性条件下，可与酚试剂（磷钼酸—磷钨酸化合物）反应，生成蓝色化合物。其颜色深浅与蛋白质的含量相关，且灵敏度比双缩脲反应高100倍，可测定微克水平的蛋白质含量。因此该反应是蛋白质浓度测定的常用方法。但要注意，该试剂只与蛋白质分子中的酪氨酸、色氨酸反应，因此反应结果受蛋白质中酪氨酸、色氨酸含量的影响，即不同的蛋白质其酪氨酸、色氨酸含量不同而使显色强度有所差异。要求作为标准的蛋白质其相关氨基酸含量应与样品接近，以减少误差。

（六）蛋白质的吸收光谱特点

酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸在近紫外区（200～400nm）有吸收光的能力，蛋白质由于含有这些氨基酸，所以也有紫外吸收能力，一般最大吸收波长在280nm处，因此能利用分光光度法很方便地测定样品中的蛋白质含量。