四、氧化磷酸化

四、氧化磷酸化

（一）氧化磷酸化的概念

氧化磷酸化作用指的是与生物氧化作用相伴而发生的磷酸化作用，是将生物氧化过程中释放的自由能用于ADP和无机磷酸生成高能ATP的作用。氧化磷酸化（oxidative phosphorylation）是需氧细胞生命活动的主要能量来源，是生物产生ATP的主要途径。生物体内通过生物氧化合成ATP的方式有两种，即底物水平磷酸化和电子传递磷酸化，通常说的氧化磷酸化即指后者。

1.底物水平磷酸化

在底物氧化过程中，形成了某些高能中间代谢物，再通过酶促磷酸基团转移反应，直接偶联ATP的形成，称为底物水平磷酸化（substrate-level phospharylation）：

X～P+ADP→XH+ATP

式中X～P代表在底物氧化过程中形成的高能中间代谢物，例如糖酵解中生成的1，3-二磷酸甘油酸和磷酸烯醇式丙酮酸以及三羧酸循环中的琥珀酰CoA等。

2.氧化磷酸化

电子从NADH或FADH2经电子传递链传递给分子氧并形成水，同时偶联ADP磷酸化生成ATP的过程，称为电子传递的磷酸化或氧化磷酸化（oxidative phosphorylation），是需氧生物合成ATP的主要途径。

在由NADH到分子氧的电子传递链中，电子传递过程中自由能有较大变化的部位即是氧化-还原电位有较大变化的部位。呼吸链中在3个部位有较大的自由能变化，这3个部位每一步释放的自由能都足以保证由ADP和无机酸形成ATP。这3个部位分别是：NADH和CoQ之间的部位；细胞色素b和细胞色素c之间的部位；细胞色素a和氧之间的部位。

电子传递过程是产能的过程，而生成ATP的过程是贮能的过程，因此可以说电子传递过程与生成ATP的过程是相偶联的。试验研究表明一对电子通过NADH呼吸链到分子氧的传递，可形成2.5个ATP；一对电子通过FADH2呼吸链，则可形成1.5个ATP。

（二）氧化磷酸化作用机理

氧化与磷酸化作用如何偶联目前主要有3种假说：化学偶联假说、构象偶联假说和化学渗透假说。化学偶联假说认为电子传递和ATP生成的偶联是通过在电子传递中形成一个高能共价中间物，它随后裂解将其能量供给ATP的合成；构象偶联假说认为在电子传递过程中引起线粒体内膜上的某些膜蛋白或ATP酶构象改变，当此构象再复原时，释放能量促使ADP和Pi合成ATP。化学渗透假说（chemiosmotic hypothesis）是由英国生物化学家Peter.Mitchell 1961年首先提出，后经大量的研究、充实，目前得到了多数人的赞同，但仍有一些问题尚待解决，图11-13是该假说的示意图。化学渗透假说的要点如下：

（1）呼吸链中递氢体和递电子体交替排列，有序地定位于完整的线粒体内膜上，使氧化还原反应定向进行。

（2）电子传递链有着H+泵的作用，能定向地将H+从基质泵到内膜外。一对电子经NADH呼吸链传递给O2时，在内膜中往返3次，每次泵出2个H+（图11-13），如经FADH2呼吸链则往返两次。

（3）完整的线粒体内膜有选择透过性，不能让泵出的H+返回基质，致使膜外侧[H+]高于膜内侧而形成跨膜pH梯度（ΔpH），同时也产生跨膜电位梯度（ΔΨ），这两种梯度是电子传递所产生的电化学势能（图11-13中的A）。

（4）内膜上嵌有F0F1-ATP合酶（synthase）。它有特殊的质子通道，当膜外侧的H+经此通道流回线粒体基质时，电化学势能释放，ΔpH和ΔΨ被解除；此时F0F1-ATP合酶则利用电化学势能释放的自由能驱动ADP和Pi合成ATP（图11-13中的B）。

①伴随电子传递的质子定向运送，XH2为细胞色素c还原酶复合体中的一个假设中间体。

②逆向的质子回流驱动F0F1-ATP合酶合成ATP。

F0F1-ATP合酶由F0和F1两部分组成，定向地嵌在内膜上，F1伸向基质，F0埋入膜内（图11-14）。研究发现，所有需氧生物线粒体内膜的F1都是由5种不同的多肽链组成的寡聚体。虽然与膜分离的可溶性F1具有水解ATP的活性，但它的生物学功能是催化ATP

合成，因此称它为ATP合酶（synthase）。F0是由4条多肽链组成的内在蛋白，分子内具有特殊的质子通道，F0和F1结合在一起，共同组成F0F1-ATP酶复合体。当H+从膜外侧经质子通道流回膜内基质时，驱动了ATP合酶（F1）催化ATP的合成反应。

（三）氧化磷酸化的解偶联和抑制

正常情况下，电子传递和磷酸化是紧密结合的。在有些情况下，电子传递和磷酸化作用可被解偶联。(https://www.daowen.com)

1.特殊试剂的解偶联作用

不同的化学试剂对氧化磷酸化作用的影响方式不同，根据它们的不同影响方式可划分为3大类，一类称为解偶联剂，另一类称为氧化磷酸化抑制剂，第三类称为离子载体抑制剂。

（1）解偶联剂　解偶联剂（uncouplers）的作用是使电子传递和ATP形成的两个过程分离，它只抑制ATP的形成过程，不抑制电子传递过程，使电子传递产生的自由能都变为热能。这种试剂使电子传递失去正常的控制，亦即不能形成线粒体膜内外的氢离子梯度，结果造成氧和底物过分地利用而能量得不到贮存。典型的解偶联剂是弱酸性亲脂试剂2，4-二硝基苯酚（2，4-dinitrophenol, DNP），解偶联剂只抑制氧化磷酸化的ATP形成，对底物水平的磷酸化没有影响。

（2）氧化磷酸化抑制剂　氧化磷酸化抑制剂（inhibitors）的作用特点是抑制氧的利用又抑制ATP的形成，但不直接抑制电子传递链上载体的作用，这一点和电子传递抑制剂不同。氧化磷酸化抑制剂的作用是直接干扰ATP的生成过程，寡霉素（oligomycin）就属于这类抑制剂。

（3）离子载体抑制剂　离子载体抑制剂（ionophore）是一类脂溶性物质，能与某些离子结合并作为它们的载体使这些离子能够穿过膜，它和解偶联试剂的区别在于它是除H+以外其他一价阳离子的载体。

2.激素控制褐色脂肪线粒体氧化磷酸化解偶联机制

一种褐色脂肪组织（brown adipose tissue）又称褐色脂肪，由大量三酰基甘油和大量线粒体的细胞构成，线粒体内的细胞色素使脂肪呈褐色，褐色脂肪的产热机制是线粒体氧化磷酸化解偶联的结果。褐色脂肪线粒体内含有一种激素称为产热素（thermogenin），是一种由两个亚基形成的二聚体蛋白质，这种激素只存在于褐色脂肪线粒体中，它控制着线粒体内膜对质子的通透性。

（四）线粒体外NADH的氧化磷酸化作用

线粒体内NADH可以直接进入呼吸链被氧化，但细胞液内的NADH无法透过线粒体内膜进入线粒体内氧化，但通过两种“穿梭”途径可以解决胞液内NADH氧化的问题：一种称为α-磷酸甘油穿梭途径（glycerolα-phosphate shuttle），另一种称为苹果酸-天冬氨酸穿梭途径（malate-aspartate shuttle）。

1.α-磷酸甘油穿梭途径

由糖无氧分解过程产生的NADH虽不能穿过线粒体内膜，但是NADH上的氢和电子却可以进入到线粒体内膜，在这里起电子载体（carrier）作用的即是α-磷酸甘油（glycero l-α-phosphate）。后者可以容易地穿梭于线粒体的内膜，起到穿梭（shuttle）搬运作用，其机制见图11-15。

图11-15中所示的穿梭作用的第1步是氢和电子从NADH转移给磷酸二羟丙酮形成α-磷酸甘油，催化这一反应的酶称为α-磷酸甘油脱氢酶（glycerol-α-phosphate dehydrogenase），该反应是在细胞液中进行的。α-磷酸甘油借助线粒体内膜上的α-磷酸甘油脱氢酶，将电子转移到线粒体内膜上的α-磷酸甘油脱氢酶的辅基FAD分子上，α-磷酸甘油转变为磷酸二羟丙酮，FAD还原为FADH2（酶-FADH2），磷酸二羟丙酮能够通过线粒体内膜扩散到细胞液中，这就使α-磷酸甘油完成了携带NADH氢和电子进入线粒体内的使命。

图11-15　α-磷酸甘油穿梭途径

图11-15中所示的穿梭作用的第1步是氢和电子从NADH转移给磷酸二羟丙酮形成α-磷酸甘油，催化这一反应的酶称为α-磷酸甘油脱氢酶（glycerol-α-phosphate dehydrogenase），该反应是在细胞液中进行的。α-磷酸甘油借助线粒体内膜上的α-磷酸甘油脱氢酶，将电子转移到线粒体内膜上的α-磷酸甘油脱氢酶的辅基FAD分子上，α-磷酸甘油转变为磷酸二羟丙酮，FAD还原为FADH2（酶-FADH2），磷酸二羟丙酮能够通过线粒体内膜扩散到细胞液中，这就使α-磷酸甘油完成了携带NADH氢和电子进入线粒体内的使命。

α-磷酸甘油穿梭途径将NADH的氢和电子转移进入电子传递链进行氧化磷酸化所利用的电子传递载体是FAD而不是NAD+，这就使从1分子NADH脱下的电子通过氧化磷酸化最后生成1.5个ATP分子。

2.苹果酸—天冬氨酸穿梭途径

在心脏和肝细胞液内NADH的电子进入线粒体是通过苹果酸—天冬氨酸穿梭途径（malate-aspartate shuttle）完成的。在细胞液中NADH的电子由苹果酸脱氢酶（cytoplasmic malate dehydrogenase）催化传递给草酰乙酸使之转变为苹果酸，同时NADH氧化为NAD+。苹果酸通过苹果酸-α-酮戊二酸载体（malate-α-ketoglutarate carrier）穿过线粒体内膜并在线粒体基质内由苹果酸脱氢酶催化转变为草酰乙酸，NAD+在线粒体基质内形成了NADH。线粒体基质内的草酰乙酸并不易透过线粒体内膜，由草酰乙酸经过转氨基作用形成天冬氨酸，通过谷氨酸—天冬氨酸载体透过线粒体膜转移到细胞液，随后再通过转氨基作用又转变为草酰乙酸。这条途径的最终结果是将细胞液中NADH所带的氢和电子转移到了线粒体基质内，随后进入电子传递链并产生2.5个ATP分子。苹果酸-天冬氨酸穿梭途径见图11-16。

（五）能荷

由于ATP、ADP和AMP对于许多反应的变构调节都很重要，D.E.Atkinson曾提出，细胞的能量状态可用能荷（energy charge）来表示。他认为能荷是细胞中高能磷酸化合物状态的一种数量上的衡量，能荷的大小可以说明生物体中ATP-ADP-AMP系统的能量状态。能荷的定义可用下式表示：

从以上方程式可以看出，储存在ATP-ADP系统中的能量与ATP的摩[尔]数加上

ADP（ADP相当于半个ATP）的摩[尔]数成正比，即能荷的大小决定于ATP和ADP的多少。能荷的数值可以从零（所有的腺苷酸都是AMP时）至1.0（所有腺苷酸都是ATP时）。大多数细胞维持的稳态能荷状态在0.8～0.95这一相当狭窄的范围内。