支气管肺泡灌洗液检查项目及临床应用进展

五、支气管肺泡灌洗液检查项目及临床应用进展

■（一）肺泡灌洗液实验室检查项目进展

除了进行常规形态学、微生物、肿瘤标志物、细胞因子、基因测序等检查之外，近年来也出现了一些新的指标研究。许多研究者还开展了对BALF行质谱、蛋白质组学、表面活性物质等检查研究，部分已经可用于临床检查，提供临床诊断和病情评估信息。

1.基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI—TOF MS）从样品中快速鉴定微生物对于进一步缩短微生物标本报告时间至关重要。MALDI—TOF MS技术是一种软电离新型有机质谱，可在几分钟内对不同种类的病原菌进行鉴定。和以往病原菌鉴定方法相比，在鉴定速度上有了质的突破，极大地减少了标本鉴定时间，彻底改变了微生物学的常规操作。结合MALDI Biotyper抗生素药敏试验快速测定法（MBT—ASTRA），在数小时内即可得出药敏试验结果。MALDI—TOF MS快速检测细菌的方案目前可用于血液、尿液和其他体液（如腹膜、滑膜和脑脊髓液等）。Driessche LV等人近期首次开发并评估MALDI—TOF MS用于快速鉴定牛BALF样品中的呼吸道致病菌的可行性，发现该技术可将标本检测时间从24～48 h缩短到6.5 h，且该技术很容易应用于临床实验室。与经典细菌培养技术联用可以更好地支持临床早期进行抗菌治疗。

2.蛋白质组学和近期新的细胞因子研究进展 BALF蛋白质来源包括驻留细胞或通过肺泡—毛细血管屏障的被动和主动扩散。更好地了解肺蛋白质组的正常成分，对评估呼吸系统疾病破坏正常肺生理学时所发生的改变至关重要。在BALF中检查到的最丰富的蛋白质是血浆蛋白质（白蛋白、转铁蛋白、α1抗胰蛋白酶、免疫球蛋白A和G），其中人血清白蛋白占BALF总蛋白的90%。大多数间质性肺病的特征在于BALF中血浆蛋白质的富集，这是由慢性损伤和炎症引起的屏障通透性增加的结果。表面活性剂相关蛋白（SP—A、SP—B、SP—D）、克拉拉细胞蛋白（CC—16、CC—10）、黏蛋白相关抗原等也微量存在于血清中。

肺泡灌洗液的蛋白质组学分析对于肺部疾病如哮喘及慢阻肺、特发性肺纤维化、囊性纤维化、结节病、急性呼吸窘迫综合征等的蛋白质标记物和生化代谢有重要意义。对肺泡灌洗液的蛋白质组学分析主要有两种方法：一是先用双向凝胶电泳方法将蛋白质分离，然后用串联质谱来识别蛋白质水解产生的多肽；二是用聚丙烯酰胺凝胶根据分子量的不同对蛋白质进行分离，将分离的蛋白质通过考马斯亮蓝染色等使其可视化，将这些蛋白质分为一个个点，对这些蛋白质进行凝胶块切除后用酶消化并进行质谱分析，质谱分析包括高效液相色谱分析和串联质谱分析。后一种方法又称为鸟枪蛋白质组学，它比第一种方法更易接受，因为它速度快且能以更自由的方式进行量化和自动化。但蛋白质组学研究有其局限型，因为非病理性的高分子量蛋白质在肺泡灌洗液中含量很丰富，所以检测并不丰富的病理蛋白质是很困难的，需要在前期对肺泡灌洗液进行一些特殊处理。生物样本固有的特性如蛋白质浓度过高（需要稀释）、不溶性的成分及生物盐会干扰蛋白质组学的分析，可以对灌洗液进行离心去除一些不溶成分，然后再进行储存或者分析，采用包括透析、大小排阻过滤、蛋白质沉淀或反向色谱等方法可对灌洗液进行脱盐处理。

BALF中白细胞介素27（IL—27）的表达水平可以用于肺结核的诊断和鉴别诊断。IL—27的cutoff值取7.867 pg/ml时，鉴别肺癌和肺结核（痰阴性和痰阳性PTB）的敏感性为68.8%，特异性为100%；cutoff取6.012 pg/ml时，对肺结核现症感染和既往肺结核鉴别的敏感性和特异性均为100%。肺结核的风险与BALF中的IL—27和腺苷脱氨酶浓度正相关，提示BALF中IL—27是肺癌和肺结核及既往肺结核的一种敏感而特异性的鉴别诊断标志物。涎液化糖链蛋白6（KL—6）、胰岛素样生长因子结合蛋白4（IGFBPW）在特发性肺纤维化（IPF）患者BALF和血清中均增高，且与患者的肺功能相关，KL—6和IGFBPW之间呈现正相相关，可作为IPF患者病情监测及疗效判断的评价指标，可采用商品化的ELISA试剂盒进行检测，可能需要对BALF进行适当浓缩后检测。肺泡灌洗液中超氧化歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）和髓过氧化物酶（MPO）等氧化指标动态变化，有可能可以帮助呼吸机相关性肺炎（VAP）的诊断。SOD、MDA、MPO活性的检测已有商品化试剂盒提供。

3.流式细胞检测 流式细胞仪可以检测肺泡灌洗液细胞成分和细胞的免疫表型，对多种疾病进行鉴别诊断，在临床广泛应用，流式的优势使其成为诊断这些疾病的重要一部分，与其他诊断项目相结合可以更好地服务于临床。

用流式细胞检测肺泡灌洗液中的CD4/CD8已很常用。CD4/CD8检测对很多疾病都有辅助诊断意义，如慢性阻塞性肺疾病、结节病、肺癌、结核等。囊性纤维化肺移植受者的肺重症患者BALF中CD4+ T细胞比例下降和CD8+ T细胞比例增加与发生严重闭塞性细支气管炎综合征（BOS）密切相关。除此之外，有研究报道对于哮喘疾病还可以进行灌洗液或血液中细胞因子的检测，如Th2细胞因子IL—4、IL—5和IL—13的检测，嗜酸性细胞趋化因子受体CCR3和中性粒细胞表面活性因子的检测。Irvin C等通过多色流式细胞仪和共聚焦荧光显微镜对52例哮喘患者及对照组肺泡灌洗液中Th2和Th17细胞检测后发现哮喘患者中Th2/Th17双阳性概率更高。对于特发性嗜酸细胞性肺炎的患者其肺泡灌洗液中嗜酸细胞表面CD11a（淋巴细胞功能相关抗原—1，LFA—1）、CD11b（Mac—1）、CD18、CD49d（很晚激活抗原—4，VLA—4）、CD62L（L—selectin）表达水平升高。Kaiser Y等对33例肺结节患者和9例对照组BALF进行研究，用流式细胞仪及多色荧光免疫斑点试验对CD4细胞的转录因子、趋化因子受体和T细胞受体的表达、增殖和细胞因子产生进行了评估，发现肺中T—bet+RORγT+CXCR3+CCR6+CD4+ T细胞及Th17相关细胞因子的增加预示结节病患者的预后良好。在包括结节病、肺结核、非结核性感染、过敏性肺炎、非特异性间质性肺炎、机化性肺炎、药物诱导肺部疾病、其他间质性肺疾病等391例肺泡灌洗液研究中发现，结节病患者较其他疾病CD103+CD4+/CD4+值较低，可以作为诊断参考但尚不能单独作为一个诊断的标志物。此外，通过流式免疫表型分析识别肺泡灌洗液中白血病细胞、淋巴瘤细胞也是辅助诊断白血病和淋巴瘤细胞肺部浸润的重要和关键技术，可以获得确定性诊断。

■（二）肺泡灌洗液检测临床应用及进展

实际临床工作中对肺泡灌洗液的检查尤其是对感染性疾病的检查，需要综合多种技术，包括微生物培养、形态学染色检查、核酸分子检查等。BALF分子检查对于病毒感染尤其重要，可能更早地检出病原体，辅助早期诊断和早期临床处理。肺泡灌洗液除了做临床疾病诊断之外，对于疾病的发病机制、疗效评估和预后判断均有较为重要的作用。

1.肺部疾病的诊断

（1）肺部感染：对BALF进行培养，如果能分离出相应的病毒、真菌或细菌，便可协助判断出是否为此类病原体感染引起的肺炎。细菌感染性疾病中BALF形态学可见中性粒细胞比例明显增高，同时可见凋亡细胞、细胞坏死、噬菌细胞、细菌等。结核性感染肺疾病患者BALF中可见淋巴细胞比例增高、多核巨噬细胞、抗酸染色阳性等。真菌感染肺疾病患者BALF中可见真菌孢子或菌丝。细菌真菌培养等病原学的检查有助于确诊，并可开展药物敏感试验。BALF诊断肺孢子菌肺炎（PCP）的敏感性为90%～95%或更高。PCR检测或基因测序可以进一步提高肺孢子菌临床检出率，并已在临床开展。病毒性感染性疾病BALF中可见病毒感染引起的细胞病变效应，包括病毒包涵体和其他细胞形态学改变，确诊则有赖于病原学检查，包括病毒分离、血清学检查及病毒抗原和病毒基因的检测。

重症监护病房（ICU）是集中收治各科室高龄、危重患者的专业科室，同时也是医院内发生感染的高发科室。高龄肺炎患者多缺乏发热、咳痰等呼吸系统典型症状，其病情发展迅速，容易发生漏诊、误诊的情况。高龄肺炎主要是以革兰阴性菌为主要病原菌，其中铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌最为常见，且耐药情况严重。因而针对ICU高龄肺炎患者准确、及时地进行BALF细菌培养和药敏试验等病原学诊断，并给予合理的抗菌药物治疗，不仅可以降低ICU患者之间相互的感染，也能够提升高龄肺炎患者的治愈率。现有数据表明，急诊监护室部分重症肺部感染、呼吸机相关性肺炎患者，包括免疫缺陷合并肺部感染者肺泡灌洗液病原学诊断敏感性为40%～93%，特异性为45%～100%。艾滋病患者肺部感染BALF病原学诊断阳性率可达到84.7%，病原体主要为CMV、耶氏肺孢子菌、曲霉菌、隐球菌、马尔尼菲蓝状菌、分枝杆菌。造血干细胞移植患者移植后由于免疫抑制剂的使用也容易出现肺部感染，传统的微生物培养、显微镜下的病原检查、核酸分子检测（PCR）和血清学研究是诊断的主要手段，BALF液中病原菌检出率达到40%。除了诊断之外，BALF中的各种异常也可以提示临床采取进一步针对性的治疗策略。

（2）肺部肿瘤：中心性肺癌依靠纤维支气管镜检查即可确诊，周围性肺癌超出了支气管镜检查范围。BALF可用于周围性肺肿瘤和肺部播散性恶变的诊断，辅助提高阳性检测率。BALF中细胞组成和细胞因子浓度反映了肿瘤微环境的变化，BALF中的成分可以很好地表征肺癌患者的局部免疫反应。可以采用流式细胞术对各种细胞表型进行精确评估，对表面和细胞质内分子进行定量分析。BALF中的肿瘤标志物如癌胚抗原（CEA）、鳞状细胞癌（SCC）抗原、Cyfra 21—1和神经元特异性烯醇化酶（NSE）在周围性肺癌BALF中具有重要诊断价值。值得注意的是，许多指标的变化与烟草烟雾影响相关，可能会影响结果的判断。总之，标准化BALF检测在肺癌诊断和全身治疗前评估、局部免疫反应监测方面具有重要作用。

（3）间质性肺病（ILD）：ILD是一组异质性非肿瘤和非感染性肺部疾病的总称，基本病变是肺泡炎症和间质纤维化，疾病种类多达200多种。ILD主要根据临床及影像学等来进行诊断，BALF的细胞学和流式细胞仪分析检测对其有重要的辅助作用。美国胸科协会官方指南对弥漫性ILD和急性弥漫性ILD何时采用支气管肺泡灌洗及BALF细胞学分析，给出了临床应用指导原则（图1—1）。BALF检查通常能够提供ILD患者的有核细胞和无细胞成分的类型和数量的变化，部分特征性细胞类型的增多与特定的ILD相关。间质性肺疾病中与特定BALF细胞类型百分比增加相关，如淋巴细胞＞15%常见于结节病、非特异性间质性肺炎（NSIP）、过敏性肺炎、药物性肺炎、胶原血管疾病、放射性肺炎、隐源性机化性肺炎（COP）、淋巴增生性疾病；中性粒细胞＞3%常见于胶原血管疾病、特发性肺纤维化、感染（细菌、真菌）、吸入性肺炎、支气管炎、石棉沉积病、急性呼吸窘迫综合征（ARDS）、弥漫性肺泡损伤（DAD）；嗜酸性粒细胞＞1%常见于嗜酸性肺炎、药物性肺炎、骨髓移植、哮喘和支气管炎、Churg—Strauss综合征、过敏性支气管肺曲霉病、感染（细菌、真菌、蠕虫、肺囊虫）、霍奇金病。许多临床医生已经将此技术用于指导ILD鉴别诊断（图1—2）。

BAL用于区分不同类型的ILD仍然具有较大的挑战性，但在临床表现和放射学数据的背景下进行结果解释时，BALF检查确实是非常有用的诊断手段。BALF的外观、细胞总数和分类、流式免疫分析结果、细胞因子分析结果等均为ILD诊断和鉴别诊断有重要的帮助。常见几种间质性肺病及BALF的临床特点如下（表1—4）。

1）肺泡蛋白沉积症（PAP）及BALF表现：PAP是一种少见的肺部疾病，临床医师难以做到快速准确诊断。开胸肺活检被认为是“金标准”诊断。BALF涂片瑞—吉染色和石蜡包埋切片均可见大量无定形蛋白物质，PAS染色阳性。通过BALF的诊断方法似乎比经支气管活检更准确，与手术活检相比，更方便、安全。

2）肺出血—肾炎综合征（Goodpasture综合征）：肺泡灌洗液检查为粉红色，镜检有大量的红细胞及含铁血黄素细胞。

3）嗜酸性粒细胞肺病：BALF中嗜酸性粒细胞比例明显增高。

4）过敏性肺炎：BALF中淋巴细胞比例增高，可见肥大细胞（组织嗜碱细胞）增高。

5）淋巴细胞性间质性肺炎：BALF中淋巴细胞比例增高。

6）脂质性肺炎：BALF中可见较多的泡沫细胞。

7）肺含铁血黄素沉着症：BALF中可检出含铁血黄素细胞。

8）肺结节病：BALF的细胞成分和T淋巴细胞亚群的分析对结节病的诊断、活动性判断及预后有一定的价值。活动性结节病患者BALF淋巴细胞明显增高，特别是CD4+细胞明显增加，CD8+增加多见于过敏性肺炎、特发性肺纤维化、病毒感染及药物反应者，CD4+/CD8+值也显著升高（正常＜2.0）。一般认为BALF淋巴细胞＞28%或CD4+/CD8+＞3.5可作为结节病活动期的指标。

9）他汀类药物性肺损伤（statin-induced lung injury，SILI）：是一种罕见但严重的他汀类药物并发症，对于SILI患者，BALF中泡沫状肺泡巨噬细胞所显示的肺部脂质沉积可能对诊断有价值。

2.评价疗效及预后 肺泡灌洗液细胞组分的改变在肺移植患者中能够辅助预测移植排异的发生。Speck NE 等回顾了文献研究，给出了不同人群，包括肺移植患者移植后肺泡灌洗液中细胞组分的构成特点（表1—5），并根据灌洗液细胞总数及部分细胞比例的改变提示临床移植排异的风险，但相关结果仍需要结合经支气管镜活检结果综合分析。表1—5中所列部分细胞组分的范围，因区分了吸烟者与非吸烟者且纳入病例数较少，与本书采用的BALF细胞组分参考区间略有差异，供读者讨论参考。

血清和BALF中YKL—40水平是特发性肺纤维化患者（IPF）生存的预测指标，其升高与IPF患者存活不佳有关。CCL18可作为特发性间质性肺炎（IIP）和系统性硬化症（SSc）中肺纤维化活动的指标，监测CCL18可能是评估纤维化肺病的新指标，也为临床治疗提供新靶位。

3.发病机制的研究 BALF检查是很多肺部疾病如结节病、过敏性肺炎、特发性间质纤维化、支气管哮喘、急性呼吸窘迫综合征等机制研究的重要手段。BALF巨噬细胞中ET—1水平升高可促进肺结节病纤维化的进程。BALF细胞因子与肺纤维化的关系及其进展提示细胞因子参与了间质性肺病的发病机制，因此可以作为潜在的治疗靶点，BALF细胞因子和趋化因子也可作为系统性硬化症患者间质性肺病结果的标记和预测因子。来自小样本的南非病例首次提供了儿童支气管肺泡灌洗液的相关数据：健康儿童肺泡灌洗液主要成分为巨噬细胞，肺炎儿童患者灌洗液中中性粒细胞明显增加。外源性肺泡活性剂的应用可以刺激IL—10和IL—12分泌增加，减轻局部炎症疾病状态。

因此，有关BALF中各种成分的检查和临床应用研究日益增多，必然会发现更多有助于疾病诊断、病情评估的技术和指标。传统的BALF形态学技术与各种新手段的综合运用和分析，将大大提高临床对肺部疾病早诊断、早治疗的能力。