一、表皮替代物

1.自体表皮细胞膜片　自体表皮细胞膜片是在合适的载体上培养自体表皮细胞，在尽可能短的时间内形成表皮细胞膜片后用于移植，重建创面表皮层。最早研究成功的永久性皮肤替代物为体外培养的自体表皮细胞膜片（cultured epithelial autografts，CEA）。1975年，Rheinwald等和Green利用表皮细胞培养和传代扩增技术，以3T3细胞作为滋养层连续培养人类表皮角质形成细胞获得成功，研制出了可移植的表皮细胞膜片，成为创面治疗的一个里程碑。Green等随即提出构想，将培养的表皮细胞融合成片后用于修复自体皮肤缺损。1981年，O'Conner等首次应用此方法在体外培养出适于人自体表皮移植的细胞膜片，在2例烧伤后的肉芽创面上，培养的表皮细胞膜片附着良好，可以起到创面修复的作用。培养的自体表皮细胞膜片能用少许的自体皮肤提供大面积创面的永久性覆盖，重建了表皮，阻止水分丢失和细菌污染，提高病人的生存机会，从组织相容性来讲，这是理想的皮肤移植方式。但自体表皮细胞膜片易碎，技术要求高，操作复杂，培养时间长，要获得足够的表皮细胞，需要2～3周；需要取自体皮肤来获得表皮细胞，造成新的创面；价格昂贵；移植后抗感染能力差。移植是否成功受创面状况、病人一般情况和医生经验的影响较大，而且移植后成功率很不稳定，愈合后瘢痕挛缩严重，弹性差，不耐磨，易破溃，不可避免地出现许多功能和外观上的退化，如瘢痕收缩、水疱形成、残余创面等（图11-1）；如将其和真皮基质联合移植可提高移植成功率和创面愈合质量。这种方法培养的是成熟或比较成熟的细胞，其扩增次数、增殖能力有限。自体表皮细胞膜片不是理想的永久性皮肤替代物，因此，单纯的角质形成细胞培养与移植的方法目前已趋于淘汰。

图11-1　自体表皮细胞膜片移植后易形成水疱(https://www.daowen.com)

2005年，Kamolz等提出“Viennese”培养方法，该法是在含人成纤维细胞的纤维蛋白凝胶上种植表皮细胞。优点在于：皮片扩展性好，培养时间短，无需Dispase酶分离。

单纯表皮细胞膜片在体外培养时大部分为终末细胞，进一步增殖分化能力差，为克服这一缺点，目前临床和基础研究重点为干细胞移植治疗，包括表皮干细胞（epidermal stem cells，ESC）、间充质干细胞（mesenhymal stem cells，MSC）、成体干细胞、胚胎干细胞。ESC在正常情况下，保证了皮肤的微环境和毛发生长，在组织损伤后参与其修复，同时其也是潜在的多能干细胞，完全可以利用其构建出具有完整表皮、真皮、皮肤附属器的功能健全的人工皮肤，实现创面由暂时性解剖修复向永久性功能修复的转变。MSC诱导分化为表皮细胞、血管内皮细胞和皮脂腺导管细胞已获初步成功。研究表明：应用MSC治疗难愈性创面，表皮、微血管、成纤维细胞及胶原的再生速度及数量均明显提高，说明MSC可以修复皮肤创面损伤，提高创面愈合质量。成体干细胞同样具有多分化潜能，其中骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenhymal stem cells，BMSCs）和脂肪源干细胞已有大量研究及部分临床应用，在个体化治疗中已应用于骨、软骨、心肌再生等领域。在群体化治疗中需要解决同种异体移植的免疫原性问题。采用基因敲除技术或RNA清除技术去除抗原可能解决异基因细胞同种移植的免疫反应，但也有可能影响被敲除基因的其他功能。最近，美国和日本相继公布了从人皮肤成纤维细胞转化为胚胎干细胞样细胞的研究成果，为解决这些问题带来了希望。胚胎干细胞是一类在体外不分化的，具有无限增殖能力的全能干细胞，在合适的培养条件下，可以分化形成多种细胞类型。但胚胎干细胞向组织和器官定向分化是一个极其复杂的过程，目前尚未被认识。转基因表皮细胞是选择能促进创面愈合的基因如人生长激素（human-growth factor，h-GH）、表皮生长因子、成纤维细胞生长因子等转染到创面愈合密切相关的细胞中，使其大量表达相应的有生物活性的蛋白，促进创面愈合的速度和提高创面愈合质量；但如何使这些促进创面愈合的基因在体内得到稳定而较高的表达尚需进一步探讨。

2.自、异体混合表皮细胞膜片　为了缩短自体表皮细胞膜片体外构建时间和能用更少的自体表皮细胞覆盖较大的烧伤创面，人们把自、异体表皮细胞按一定比例混合后培养移植，在自体表皮细胞增殖同时，异体表皮细胞逐渐被排斥并最终被自体表皮细胞替代。1983年，Heften等用人尸体表皮细胞培养移植治疗烧伤病人取得了成功，之后这一技术得到了迅速发展。使用同种异体基因表皮细胞移植存在宿主排斥反应的问题，但在试验中发现：与异体植皮技术不同，培养的角质形成细胞不会被排斥。因为发生免疫排斥反应的主要原因是人表皮中的HLA-DR（+）和CD-1a（+）的朗格汉斯细胞，经过体外原代、次代培养后，朗格汉斯细胞几乎全部消失，培养的角质形成细胞不会刺激异体淋巴细胞增殖。培养的角质形成细胞异体移植后对机体有无影响，可用以下方法检测：①血型标记物。②DNA指纹图谱。③PCR-RFLP（限制性内切酶片段长度多态性）。④人类白细胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）基因位点分析。⑤PCR扩增染色体特异性DNA片段。⑥5-溴脱氧尿嘧啶核苷（5-Bromo-2-Deoxyuridine，BrdU）标记角质形成细胞。⑦异种的角质形成细胞用免疫组化和荧光标记原位杂交检测Y染色体等。以上均有助于角质形成细胞异体移植后的转归和免疫研究。与自体表皮细胞培养移植不同，移植的同种异体表皮细胞其主要作用是暂时覆盖创面，而最终要被宿主细胞取代。Larochelle等报道用含有少于5%自体表皮细胞的混合表皮细胞膜片覆盖于创面。自、异体表皮细胞混合培养移植虽可缩短时间、节省自体皮源，但单纯细胞膜片移植的一系列缺点依然存在。一些学者将自体与异体表皮细胞按一定比例混合种植于无细胞真皮基质表面，在体外培养形成含自体表皮细胞和异体表皮细胞的复合皮，然后移植于小鼠，移植后人表皮细胞随时间延长，数量逐渐减少并最终被小鼠自体表皮细胞替代。