二、真皮替代物
表皮替代物主要用于较表浅的创面，对于范围较大、较深的创面，由于无真皮层的营养支撑，表皮替代物不能成活，故需要真皮替代物进行机械保护。皮肤替代物中的真皮成分可以阻止创面收缩，增加机械稳定性。从人尸体上取下的全厚皮肤，经化学处理去除其中的表皮和真皮细胞（抗原细胞）后，制成脱细胞真皮基质（acellular dermal matrix，ADM），可单独使用或与自体表皮培养细胞联合治疗各种创面。真皮成分在创面修复及愈合后瘢痕调控中都具有极其重要的作用，可增加皮肤弹性、柔软性及机械耐磨性，减少瘢痕增生和挛缩，改善愈合后外观及功能。真皮替代物包括脱细胞真皮和人工合成真皮。
1.脱细胞真皮 又叫无细胞真皮，主要是指经酶消化、高渗盐浸泡等方法去除细胞成分，而保留完整的胶原纤维及基膜等细胞间质的异体、异种皮。细胞间质的主要成分有胶原、层粘连蛋白、纤维连接素、氨基葡聚糖（如透明质酸）和蛋白聚糖（如硫酸软骨素）等。由于这些成分在动物进化中非常保守，其免疫抗原性极低。细胞间质对细胞的生长、分化和迁移起重要调控作用，它可以结合细胞因子，调节细胞因子的浓度和活性，还能促进表皮的增殖、分化和基膜的形成，诱导成纤维细胞和血管内皮细胞有序地生长、分化等。Wainwright首先将同种异体无细胞人真皮基质Alloderm应用于临床。细胞真皮基质还有血管化快的特点，动物实验研究发现移植2周后基本血管化，再血管化过程迅速。由于异体皮来源有限，有传染疾病的危险且受到伦理学的制约，故异种无细胞真皮的研制和应用越来越受到重视。无细胞异种真皮基质的制作方法与无细胞异体真皮基质的制作方法基本相同，处理后也去除了诱发免疫排斥反应的细胞成分，并且保留了完整的细胞外基质。临床上，冯祥生等用异种（猪）无细胞真皮基质在脂肪断层、深Ⅱ度削痂至真皮深层和切痂到深筋膜层的30例临床创面复合移植成功（二步法），移植术后3～6个月，创面平整、光滑、功能良好。柴家科等发现，无细胞猪真皮和无细胞异体真皮两者在植皮存活率和收缩率方面效果非常接近，差异无统计学意义。另一方面的实验研究显示由于物种间存在组织蛋白的差异，异种无细胞真皮的免疫原性要比同种的无细胞真皮强。Srivastava等以大鼠为动物模型，发现移植异种（猪）无细胞真皮组与移植异体无细胞真皮组在术后30天比较，创面挛缩明显且存活率低，创面愈合质量较差。姜笃银等通过异种无细胞真皮的抗原性实验研究发现，异种无细胞真皮基质在宿主会产生较激烈的，但受限于细胞因子介导的体液免疫反应，导致宿主产生移植耐受和重塑。因此，异种无细胞真皮的应用还要从免疫学、组织学和分子生物学等方面进行深入研究。
脱细胞真皮取材于同种异体皮或异种皮，通过胰酶消化法、DispaseTritonX-100法、高渗盐溶液—十二烷基硫酸钠法、平衡盐浸泡法等去除细胞成分，仅保留真皮基质，但含正常皮肤的胶原纤维束及完整的基底膜结构，生物亲和性强，免疫原性低，广泛应用于烧伤、整形、口腔等学科领域。Alloderm即由同种异体皮加工制备的无细胞真皮基质，去除了能引起免疫反应的细胞成分，降低了免疫原性，移植后不被排斥，在体内可能会被吸收，具有调节、诱导宿主细胞长入的作用；可与自体表皮细胞联合移植于深度烧伤创面，愈合后不会发生瘢痕增生和挛缩（图11-2）。脱细胞异体真皮来源有限，人们常用异种（猪）皮来制备无细胞真皮基质，其来源广泛、价格便宜。脱细胞真皮基质本身无抗菌作用，有学者将其浸泡于硝酸银中，制备成含银脱细胞真皮基质，既保留了组织的基本结构和完整的胶原纤维支架，又具有较好的局部抗菌效果。
图11-2 AlloDerm外观及应用
尽管天然生物材料在皮肤组织工程中的应用研究中已经取得了很大进展，但仍有诸多问题存在。天然生物材料大规模提取困难，价格较高。不同的处理方法也会造成天然材料产品批次差异，性质难以统一，并且大多天然材料的力学性能难以符合操作的要求。
2.人工合成真皮 人工合成真皮系采用胶原、氨基葡聚糖、胶原凝胶、聚羟基乙酸等材料制成的真皮基质，与脱细胞真皮相比其可大量生产，长期保存，并可按需求目的改变其组成成分及交联物质，以增加对胶原酶的耐受性。常见的真皮替代物多使用动物来源的胶原纤维做支架。
（1）Integra Yannas等研制的双层人工皮肤Integra是真皮替代物的代表（图11-3）。Integra由牛肌腱胶原、6-硫酸软骨素交联构建成的真皮层和覆盖其上的硅胶薄膜构成，为双分子层结构，上层是很薄的硅树脂层，充当临时表皮，下层是一种含6-硫酸软骨素的牛胶原纤维网格，作用相当于真皮，硅胶膜起表皮作用，以减少水分丢失和阻止微生物入侵。移植后内层逐渐降解，病人自体内皮细胞和成纤维细胞长入形成新的真皮结构；2～3周后揭去硅胶膜，可在新生真皮组织上移植薄层网状自体皮片。这种合成真皮替代物1996年已获美国食品与药物管理局（FDA）批准用于临床。随着产品的不断更新完善，Integra在国外已较为普及使用，并成功用于治疗大面积Ⅲ度烧伤。临床应用分两步骤：先用Integra覆盖创面，于3周后用自体表皮移植，取代“假冒”的硅树脂表皮。Integra对肢体损伤、组织严重缺失的患儿，可作为早期创面的覆盖物，并可直接覆盖于裸露骨面（如髌骨），为自体皮肤移植做准备。其优点：可直接用，数量充足；缺点：需二次手术，有感染风险，价格高，更换敷料耗时长。
图11-3 Integra及其应用
（2）以尼龙网眼做支架的Dermagraft系列（图11-4）。在真皮支架中加入成纤维细胞等活性细胞称为活性真皮替代物。美国Advanced Tissue Sciences公司生产的Dermagraft，即在聚羟基乙酸和聚乳酸混合制成的真皮基质上种植来自于新生儿包皮的异体成纤维细胞后培养而成，真皮层内的成纤维细胞可分泌多种细胞外基质蛋白和多种生长因子（如表皮生长因子、血小板源性生长因子、转化生长因子等），促进基底膜形成及表皮细胞的生长分化，并能诱导血管内皮细胞生长，提高移植成功率。Dermagraft-TC内层由尼龙丝构成支架材料，表面亦采用硅胶膜。异体新生儿包皮的成纤维细胞（fibroblast，Fb）种植在尼龙网孔内，Fb在支架内增殖，分泌胶原、氨基多糖、生长因子等基质成分。Dermagraft-TC主要用于烧伤切痂后创面的临时覆盖。由于尼龙不能降解，现已少用。Dermagraft-TM则是将新生儿成纤维细胞种植于可降解的聚乳酸网上，该替代物移植后3～4周，聚乳酸网可生物降解，临床用于治疗烧伤及溃疡创面获得成功。Raguse和Gath在口腔前庭成形术中使用Dermagraft，可使前庭深度得到增加，且无瘢痕形成。此材料具有来源充足、颜色匹配好、避免损伤自体口腔黏膜等优点。Tonello等将人脐静脉内皮细胞与成纤维细胞1∶1混合后在透明质酸支架上培养3周，内皮细胞增殖形成毛细血管样结构。谢卫国等以含血管内皮细胞生长因子目的基因的腺病毒载体转染人成纤维细胞，将其接种于Integra人工皮后移植于裸鼠创面，结果显示基因修饰所致血管内皮生长因子高表达明显促进了移植皮肤替代物的血管化过程，提高了移植物成活率。
图11-4 Dermagraft外观
程树军等取胶原海绵、明胶海绵、聚乳酸/聚羟基乙酸共聚物（poly-lactic-co-glycolic-acid，PLGA）和聚羟基丁酸戊酸共聚酯（poly-hydroxy-butyrate valerate，PHBV）共4种真皮支架，与小鼠成纤维细胞和ES源表皮样干细胞体外培养，观察前者对后者黏附率的影响，及对成纤维细胞增殖的影响，结果成纤维细胞和ES源表皮样干细胞在4种支架材料上均能黏附存活，成纤维细胞能增殖，但在胶原海绵、PHBV和PLGA支架上的增殖率明显高于明胶海绵，认为几种真皮支架的细胞相容性较好，可用于新型组织工程皮肤的构建。Ma等用冻干法制备胶原/壳聚糖多孔支架，用戊二醛交联后，种植成纤维细胞，形成真皮替代物，并做动物实验，显示出良好的细胞、组织相容性及生物稳定性。Chen等用PLGA和胶原材料制成的混合网架，接种上成纤维细胞，再将其植入裸鼠背后，2周后形成真皮组织，成纤维细胞的接种效率、分布和生长状态要明显优于单纯PLGA材料。
（3）合成网膜（Biobrane）是双层膜状物，外层是硅胶膜，内层整合有胶原颗粒，可迅速与创面紧密贴附。Biobrane的优点是：①Biobrane的结构可以有效减少换药的次数。②减少止痛剂的应用，为表皮化修复提供了稳定的环境。其缺点是抑制巨噬细胞的作用。长期以来，Biobrane在临床上被用作一种临时性敷料来覆盖大面积烧伤创面。
（4）异体成纤维细胞细胞外基质真皮替代物（Transcyte）。Transcyte是将新生儿成纤维细胞接种到Biobrane的胶原层培养4～6周（图11-5）。Transcyte的优点是：①能迅速黏附在伤口表面，并刺激上皮生长。②在异体移植中的黏附性和愈合度与自体移植相当。③易于操作可以规模化制备，可冻存待用。目前，Transcyte只作为一种临时性敷料用来覆盖部分厚度烧伤创面。
图11-5 Transcyte外观(https://www.daowen.com)
（5）其他人工真皮替代物。一种源自猪小肠黏膜下层的生物产品已经在美国开发出来，作为Oasis公司创面敷料已经商品化。通过对15例病人刃厚创面（静脉性、压力性、外伤和药物所致溃疡）治疗分析，认为它是一种非常有前途的生物材料。Scott等将培养的胎儿皮肤成纤维细胞与可溶性胶原结合治疗儿童烧伤，全部病例愈合迅速。我国采用酶消化和去垢剂处理法，去除异体真皮中的细胞成分，研制成功“J-Ⅰ型脱细胞异体真皮”，取得了良好的临床效果。将胶原、硫酸软骨素、壳聚糖和成纤维细胞等按比例混合制成的真皮替代物，在体外抑菌效果作用明显，是真正具有抗菌作用的组织工程产品，而且它本身柔软，可与创面紧密结合而不留死腔，更适合于不平坦创面的修复。
（6）DED（de-epidermized dermis）是近期发展的一种新型三维真皮基质，兼具所有真皮替代物的优良特征，可供各种类型的细胞（包括来源于脐血的CD34+干细胞）贴附生长，可作为骨髓细胞培养诱导分化成角质形成细胞的传递系统，有很好的发展前景。
3.复合皮肤替代物 前两类皮肤替代物都有一定的局限性。理想的皮肤替代物应同时修复表皮和真皮组织，因为这两种成分不仅影响皮肤的功能和外形，而且还具有相互影响的机制，促进彼此的分化。复合皮是指自体刃厚表皮或自体角质形成细胞膜片（CKS）与真皮替代物在体内或体外组合的接近正常皮肤结构的一种皮肤代用品，目前复合皮已成为国内外烧伤治疗和研究中的重要课题。
真皮—表皮替代物是以可被人体逐渐降解吸收的细胞外基质（extracellular matrix，ECM）做三维支架，在其上培养扩增表皮细胞，然后将这种表皮细胞-ECM的生物复合体种植于创面，ECM逐渐降解，表皮细胞继续增殖，达到修复创面、重建功能的目的（图11-6）。ECM是种植、支持和转运表皮细胞的传递系统，既是表皮细胞附着的场所，又是良好的创面覆盖物。一种好的ECM要求理化性能良好，能被降解吸收，无抗原性，价格低廉，柔韧耐用，隔离细菌，防止水分丢失，便于应用，生产制备方便，易消毒和贮存。现使用的ECM有天然的（如3T3细胞、脱细胞真皮等）和人工合成的（如聚氨基甲酸乙酯、聚羟基乙酸、透明质酸、纤维蛋白胶原等）两种。ECM的研究和开发一直是皮肤培养移植的重要课题。真皮—表皮替代物的功能已接近自体皮肤或异体皮肤复合皮包括表皮层和真皮层，是相对意义上较为完全的皮肤替代物，可一次性修复缺损的表皮层和真皮层。
图11-6 自体表皮和异体真皮复合皮
（1）Apligraf是第一种商品化的既有表皮层又含有真皮层的组织化工程皮肤，由Organogenesis公司注册生产，是目前唯一经美国FDA批准上市的商品化器官型活性皮肤替代物，它是在含有人成纤维细胞（同种异体）的胶原凝胶表面种植异体人表皮细胞，经培养而成（图11-7）。Apligraf是较为成熟的真皮—表皮替代物的代表，它是由表皮细胞和成纤维细胞与牛Ⅰ型胶原支架共同制备的一种具有三维结构的双层活性皮肤。Apligraf最初用于烧伤早期创面的临时覆盖，现已经成功地用来治疗糖尿病病人足部溃疡、静脉淤滞性溃疡和外科手术伤口。王旭等直接在胶原膜的两面分别种植表皮细胞和成纤维细胞，经培养形成纤维母细胞—胶原膜—表皮细胞“夹心”式人工复合皮肤，该复合皮肤具有一定的机械强度和柔韧性，不易碎裂，便于手术操作。将其异体移植于临床病人，未发现明显排斥现象，移植成活率为70%。高学军等以胶原海绵为支架，培养人角质形成细胞和成纤维细胞，免疫组织化学染色显示，Ⅳ型胶原、纤维连接蛋白和层粘连蛋白呈阳性，HE染色可见均具有表皮和真皮双层结构，在形态结构上与正常皮肤相似。
Apligraf用于治疗烧伤创面、瘢痕挛缩、糖尿病足和静脉性小腿溃疡，效果较满意；但其抗感染能力弱，收缩度大，弹性差，异体表皮细胞可引起免疫排斥反应，胶原易被降解。在真皮基质中加入壳多糖可提高真皮替代物的抗菌能力，增强真皮基质的机械耐受力，延缓创面细菌胶原酶对真皮基质的降解。
（2）其他复合皮肤替代物。以合成材料为支架的复合皮肤：壳聚糖有止血、抗菌功能，并能激活介导多形白细胞。最近研究显示，壳聚糖及其衍生物在体内与大分子物质的相容性良好，很有发展前景。壳聚糖—明胶人工皮肤是利用冷冻和干燥的方法把壳聚糖和明胶融合构建成一种具有吸收性、结构不对称的双层支架，这种支架可作为一种理想的、具有柔韧性和较好的机械性能的双层皮肤替代物。双层明胶支架人工皮肤含有具有不同孔径的双层凝胶海绵体，其中的微孔结构在表皮与间质之间形成了旁分泌通路，就如同形成了表皮—真皮连接处的基底膜，可将无抗原性、易于吸收的明胶和亲水性、生物相容性好的海藻酸钠交联，形成明胶—海藻酸钠海绵体，进而培养出明胶—海藻酸钠海绵体人工皮肤。
图11-7 Apligraf外观及应用
以胶原等天然材料为支架的复合皮肤：Ⅰ型胶原蛋白是一种具备生物活性的大分子物质，对细胞的黏附、生长、增殖、分化和迁徙起着重要的作用。Kim等在双层胶原海绵体支架两侧植入体外培养的成纤维细胞和角质形成细胞，培养后，成纤维细胞长入三维的明胶海绵内。这种人工皮肤的优点是较以前的人工皮肤培养时间明显缩短，可适用于治疗大面积重度烧伤病人。将从新生儿包皮分离的成纤维细胞在制备的X型胶原—硫酸软骨素支架中培养，这种人工皮肤具有良好的稳定性和组织相容性。
OrGel是另一种活性复合人工皮肤，包含有体外培养的异体的成纤维细胞和角质形成细胞，它是将种子细胞分别接种在双层的牛胶原基质的上下两层。这种皮肤的优点是可以即刻使用，缺点是有关其临床应用资料较少。另一项研究将表皮细胞、成纤维细胞分别与PluronicF-127混匀成细胞悬液后，种植PGA形成细胞—生物材料复合物，用于修复自体全层皮肤缺损，表明成纤维细胞-PGA-Pluronic复合物移植后逐渐演变为正常真皮。
转基因皮肤替代物：转基因皮肤替代物的研制为烧伤创面覆盖提供了一条新途径。第三军医大学烧伤研究所筛选低免疫原性、低内源性病毒水平、皮肤构造与人类最为接近的猪品系，选择适宜的诱导免疫耐受基因，通过载体将其转入猪皮肤，获得具有满意抗排异效果的转基因猪皮。转基因猪皮用于烧伤创面覆盖，延长了异种皮在创面的存活时间，对瘢痕预防有一定作用。但要制备长期甚至终身不被人体排斥，能安全应用于临床的转基因异种皮仍任重而道远。
血管内皮化皮肤（endothelialize skin，ES）替代物：普通皮肤替代物缺乏血管系统供给营养，表面的上皮容易坏死脱落。血管内皮化皮肤替代物是以改良的透明质酸为支架，将取自人全厚皮片的角质形成细胞、成纤维细胞和内皮细胞以一定比例种植在支架上，在体外培养后形成有微血管网的三维生物材料，其特点是保证移植皮肤有充足的营养和氧气供应，易于成活。透明质酸是一种生物降解材料，这种血管内皮化皮肤移植后，支架降解，角质形成细胞和成纤维细胞继续增殖，达到修复创面、重建功能的目的，效果优于普通皮肤替代物。
此外，在Integra、Dermagraft、脱细胞真皮等真皮支架上种植表皮细胞及成纤维细胞，经过培养均可制成复合皮。Yang等以Ⅰ型胶原作为真皮基质与成纤维细胞共同培养形成真皮替代物，再加入表皮细胞行液—气界面培养，制成的含表皮、真皮的人工复合皮肤已成功地进行鼠移植试验。刘德伍等用异种脱细胞真皮作支架，在双面分别接种人表皮细胞和成纤维细胞，制成的复合皮表面覆盖一层融合的表皮细胞，真皮内有成纤维细胞存在。有些学者构建含转基因细胞（如含血小板源性生长因子基因的成纤维细胞、含血管内皮细胞生长因子基因的成纤维细胞、含表皮生长因子基因的表皮细胞等）的复合皮用于实验研究，可加快复合皮血管化速度，提高移植成活率和创面愈合质量。
复合皮移植后外观色泽接近正常皮肤，具有良好的弹性、耐磨性和抗挛缩性，而后者则有赖于表皮—真皮连接区（epidermal dermal Junction，EDJ）组织结构的再形成。近年来不少学者注意到复合皮移植后，表皮—真皮连接区的再生与复合皮中真皮替代物的种类密切相关，即异体真皮替代物明显优于人工真皮替代物。此外，还有人认为，复合皮结构和功能接近正常皮肤，还可能与无细胞真皮组织中含有丰富的透明质酸参与对成纤维细胞合成胶原的调控有关。刘旺等以裸鼠为动物模型，研究了无细胞异种真皮与表皮细胞悬液复合移植的效果及组织学变化，证实了该替代物可改善创面愈合质量。夏照帆等将BALB/c小鼠与人的表皮细胞进行混合培养并种植于无细胞真皮基质，结果显示可缩短培养周期且节省皮源。以异体或异种胶原作为细胞支架，再将培养的自体表皮或异体表皮细胞膜片植于其上而形成的复合皮肤，有学者研究证实，将该复合皮移植于裸鼠全层缺损创面，取得了满意效果。