荧光显微镜的构造和原理
荧光显微镜是免疫荧光细胞化学的基本工具。它是由光源、滤色系统和显微镜3部分构成，利用一个高发光效率的点光源，经过滤色系统发出一定波长的光激发标本内的荧光物质发射荧光，通过物镜和目镜系统放大以观察标本的荧光图像（如图1.1.2）。
图1.1.2 荧光显微镜的构造
（一）光源
目前多采用200W的超高压汞灯做光源，它是用石英玻璃制作，中间呈球形，内充一定数量的汞，工作时由两个电极间放电，引起水银蒸发，球内气压迅速升高，当水银完全蒸发时可达50～70个标准大气压力，这一过程一般约需5～15min。超高压汞灯的发光是电极间放电使水银分子不断解离和还原过程中发射光量子的结果。它发射很强的紫外光和蓝紫光，足以激发各类荧光物质。因此，为荧光显微镜普遍采用。受检标本内的荧光强度，取决于光源激发光的强度。高压汞灯能以最小的表面积释放出最大数量的短波光，而且亮度大、稳定。超高压汞灯可发出各种波长的光，但每种荧光物质都有一个产生最强荧光的激发光波长，所以需加用激发滤片（一般有紫外、紫色、蓝色和绿色激发滤片），仅使一定波长的激发光透过照射到标本上，而将其他光都吸收掉。每种物质被激发光照射后，在极短时间内发射出较照射波长更长的可见荧光。
超高压汞灯也散发大量热能。因此，灯室必须有良好的散热条件，工作环境温度不宜太高。
新型超高压汞灯在使用初期不需高电压即可引燃，使用一些时间后，则需要高压（约为15000V）启动，启动后，维持工作电压一般为50～60V，工作电流约为4A。200W超高压汞灯的平均寿命，在每次使用2h的情况下约为200h，开动一次工作时间愈短，则寿命愈短，如开一次只工作20min，则寿命降低50%。因此，使用时应尽量减少启动次数。灯泡在使用过程中，其光效是逐渐降低的。灯熄灭后要等待冷却才能重新启动。点燃灯泡后不可立即关闭，以免水银蒸发不完全而损坏电极，一般需要等15min。由于超高压汞灯压力很高，紫外线强烈，因此，灯泡必须置于特制的灯室中方可点燃，以免伤害眼睛和操作时发生爆炸。
（二）滤色系统
滤色系统是荧光显微镜的重要组成部分，滤片系统包括激发滤片、阻断滤片、吸热滤片和吸收紫外光滤片等。
1.激发滤片
激发滤片的作用是吸收波长较长的可见光，允许一定波长的短波光（如紫外光或蓝紫光）通过，作为荧光显微镜的激发光。激发滤片型号，各厂家名称常不统一。滤片一般都以基本色调命名，前面字母代表色调，后面字母代表玻璃，数字代表型号特点。如BG12，就是蓝色玻璃，B（blue）是蓝色的第一个字母，G（glass）是玻璃的第一个字母；或者以UV（ultraviolet，紫外线）、BV（blue-violet，蓝紫光）等标记激发滤片。我国产品的名称已统一用拼音字母表示，如相当于BG12的蓝色滤片名为QB24，Q是青色（蓝色）拼音的第一个字母，B是玻璃拼音的第一个字母。不过有的滤片也可以透光分界滤长命名，如K530，就是表示压制滤长530nm以下的光而透过530nm以上的光。还有的厂家的滤片完全以数字命名，如NO：5-58，即相当于BG12。根据光源和荧光色素的特点，可选用以下3类激发滤片，提供一定波长范围的激发光。
（1）紫外光激发滤片
此滤片可使400nm以下的紫外光透过，阻挡400nm以上的可见光通过。常用型号为UG-1或UG-5，外加一块BG-38，以除去红色尾波。
（2）紫外蓝光激发滤片
此滤片可使300～450nm范围内的光通过。常用型号为ZB-2或ZB-3，外加BG-38。
（3）紫蓝光激发滤片
它可使350～490nm的光通过。常用型号为QB24（BG12）。
最大吸收峰在500nm以上的荧光素（如罗达明色素）可用蓝绿滤片（如B-7）激发。
近年开始采用金属膜干涉滤片，由于针对性强，波长适当，因而激发效果比玻璃滤光更好。如FITC专用KP490滤片和罗达明的S546绿色滤片，均远比玻璃滤片效果好。
激发滤片分薄、厚两种，一般暗视野选用薄滤片，亮视野荧光显微镜可选用厚一些的激发滤片。基本要求是，以获得最明亮的荧光和最好的背景为准。
2.阻断滤片
阻断滤片的主要作用是吸收视野内未被标本吸收的激发光，允许标本内的物质发射的荧光通过，以获得清晰的荧光图像和保护观察者的眼睛。其与激发滤片相对应，必须选择配合使用。常用以下3种阻断滤片：
（1）紫外光阻断滤片
可通过可见光、阻挡紫外光通过，能与UG-1或UG-5组合，常用GG-3K430或GG-6K460。
（2）紫蓝光阻断滤片
能通过510nm以上滤长的荧光（绿到红），能与BG-12组合，通常用OG-4K510或OG-1K530。
（3）紫外紫光阻断滤片
能通过460nm以上波长的荧光（蓝到红），能与BG-3组合，常用OG-11K470AK 490，K510。(https://www.daowen.com)
3.吸热滤片
一般光源均含有一定量的红光，红光能产生大量热。所以，在荧光显微镜的光源附近均装有吸热滤片。
4.吸收紫外光滤片
其主要作用是吸收汞灯发射出的紫外线，允许可见光通过。当荧光显微镜作为普通光镜使用时，可将该滤片推入或转入光路中，一般荧光显微镜均附有低压光源。
（三）显微镜
1.反光镜
反光镜的反光层一般是镀铝的，因为铝对紫外光和可见光的蓝紫区吸收少，反射达90%以上，而银的反射只有70%；一般使用平面反光镜。
2.聚光镜
专为荧光显微镜设计制作的聚光器是用石英玻璃或其他透紫外光的玻璃制成的，分明视野聚光器、暗视野聚光器2种。还有相差荧光聚光器。
（1）明视野聚光器
在一般荧光显微镜上多用明视野聚光器，它具有聚光力强、使用方便的优点，特别适用于低、中倍放大的标本观察。
（2）暗视野聚光器
暗视野聚光器在荧光显微镜中的应用日益广泛。因为激发光不直接进入物镜，因而除散射光外，激发光也不进入目镜，可以使用薄的激发滤片，增大激发光的强度，阻断滤片也可以很薄，因紫外光激发时，可用无色滤片（不透过紫外光）而仍然产生黑暗的背景，从而增强了荧光图像的亮度和反衬度，提高了图像的质量，观察舒适，可发现亮视野难以分辨的细微荧光颗粒。
（3）相差荧光聚光器
相差荧光聚光器与相差物镜配合使用，可同时进行相差和荧光联合观察，既能看到荧光图像，又能看到相差图像，有助于荧光的定位准确。一般荧光观察很少需要这种聚光器。
3.物镜
各种物镜均可应用，但最好用消色差的物镜，因其自体荧光极微且透光性能（波长范围）适合于荧光。由于图像在显微镜视野中的荧光亮度与物镜镜口率的平方成正比，而与其放大倍数成反比，所以为了提高荧光图像的亮度，应使用镜口率大的物镜。尤其在高倍放大时其影响非常明显。因此对荧光不够强的标本，应使用镜口率大的物镜，配合以尽可能低的目镜（4×，5×，6.3×等）。
4.目镜
在荧光显微镜中多用低倍目镜，如5×和6.3×。过去多用单筒目镜，因为其亮度比双筒目镜高1倍以上，但研究型荧光显微镜多用双筒目镜，观察很方便。
5.落射光装置
新型的落射光装置是从光源来的光射到干涉分光滤镜后，波长短的部分（紫外和紫蓝）由于滤镜上镀膜的性质而反射，当滤镜对向光源呈45°倾斜时，则垂直射向物镜，经物镜射向标本，使标本受到激发，这时物镜直接起聚光器的作用。同时，波长长的部分（绿、黄、红等），对滤镜是可透的，因此，不向物镜方向反射，滤镜起了激发滤片的作用。由于标本的荧光处在可见光长波区，可透过滤镜而到达目镜观察，荧光图像的亮度随着放大倍数增大而提高，在高放大倍时比透射光源强。它除具有透射式光源的功能外，更适用于不透明及半透明标本，如厚片、滤膜、菌落、组织培养标本等的直接观察。研制的新型荧光显微镜多采用落射光装置，称为落射荧光显微镜。
6.CCD荧光显微
CCD是与荧光显微镜密切相关的数码摄像产品，一方面它可以将荧光显微镜拍摄的显微摄影产品通过USB 接口传输到电脑中，便于图像的采集研究；另一方面，通过荧光显微镜CCD我们可以拍摄到比单纯使用荧光显微镜更好的图片。荧光显微镜CCD可以连接荧光显微镜组成显微成像系统。
（1）使用范围
一般情况下，单独使用荧光显微镜即可以达到我们想要的成像效果，但在某些情况下，比如说当荧光比较微弱的情况下，仅仅通过荧光显微镜并不能达到理想的拍摄效果，或者我们希望可以将拍摄的荧光图片上传到电脑生成预览，修改甚至发表学术论文，这时候没有荧光显微镜CCD是不能达到要求的。
（2）CCD的特点
荧光显微镜CCD一般具有良好的弱光捕捉能力，能够捕捉到极其微弱的荧光，因此成像能力好。此外，很多荧光冷CCD生产时都对此类CCD做了制冷处理，使得此类CCD的噪音大大降低，信噪比得到很大的提高。由于其方便应用，此类CCD相机被广泛应用于荧光显微镜。