LSCM的改进与发展
近几年，LSCM的光源设计和分光采集技术有较大的改进，主要集中在如下几个方面：
（一）激光光源的可选择性
选择激光光源时，可以根据研究需要选择不同的激光器：一方面要满足研究工作对波长的需求；另一个方面要考虑激光光源的寿命。
（二）自由选择最佳波长
用棱镜狭缝分光技术配合相适宜的激光源，摆脱传统的波长滤片组的限制，连续和自由地选择最佳波长。
（三）与高速扫描功能相匹配的物镜
用于激光扫描的物镜也做了较大的改进，不但具有平场复消色差特性，而且能与高速扫描功能相匹配。(https://www.daowen.com)
（四）技术的不断改进、发展
至今又产生了新型LSCM，如针孔阵列盘式激光共聚焦显微镜和双光子共聚焦显微镜：
1.针孔阵列盘式激光共聚焦显微镜
为了解决快速变化过程的共聚焦检测问题，出现了双碟片专利技术（Yokogawa Electric 公司发明），即微透镜阵列碟片与针孔阵列碟片同步旋转技术。与常规激光共聚焦方法不同的是采用CCD作为探测器，无须载物台进行扫描运动，只要微透镜阵列碟片与针孔阵列碟片同步旋转，就可以对物体进行快速共聚焦检测，最高全幅采集帧速度达到1000帧/s，是活细胞在体荧光成像的重要工具。
2.双光子共聚焦显微镜
为了解决生物样品染料标记光漂白现象的共聚焦检测问题，需设置足够小的探测孔径，而又能获得高分辨率图像的装置。因为孔径小又会挡掉很大部分从样品发出的荧光，包括从焦平面发出的荧光，这样就要求激发光必须足够强以获得足够的信噪比。而高强度的激光会使荧光染料在连续扫描过程中迅速衰减（即光漂白现象），荧光信号会随着扫描进程的进行变得越来越弱。除此之外，在激光照射下，许多荧光染料分子会产生诸如单态氧或自由基等细胞毒素，所以实验中要限制扫描时间和激发光的光功率密度以保持样品的活性。针对活性样品的研究，尤其是活性样品生长、发育过程的各个阶段，光漂白和光毒现象将使这些研究受到很大的限制。为解决荧光检测中的上述问题，研制了“双光子共聚焦显微镜”。双光子激发的基本原理是：在高光子密度的情况下，荧光分子可以同时吸收2个较低能量（即更长的波长）的光子，在经过一个很短的所谓激发态寿命的时间后，发射出一个波长较短的光子，其效果和使用一个能量较高（即波长为长波长一半）的光子去激发荧光分子是相同的。双光子激发需要很高的光子密度，为了不损伤细胞，双光子显微镜使用高能量锁模脉冲激光器。这种激光器发出的激光具有很高的峰值能量和很低的平均能量，其脉冲宽度只有100fs，而其周期可以达到80至100MHz。在使用高数值孔径的物镜将脉冲激光的光子聚焦时，物镜的焦点处的光子密度是最高的，双光子激发只发生在物镜的焦点上，所以双光子共聚焦显微镜不需要共聚焦针孔即可提高荧光检测效率。其优点是：长波长的光比短波长的光受散射影响较小，容易穿透标本；焦平面外的荧光分子不被激发，使较多的激发光可以到达焦平面，使激发光可以穿透更深的标本；长波长的近红外光比短波长的光对细胞毒性小；只有在焦平面上才有光漂白和光毒性。所以，双光子共聚焦显微镜比普通共聚焦显微镜更适合用来观察厚标本、活细胞，或用来进行定点光漂白实验。