LSCM的工作原理

LSCM是在荧光显微镜成像基础上配置激光光源和扫描装置，在传统光学显微镜基础上采用共轭聚焦装置，利用计算机进行图像处理，对观察样品进行断层扫描和成像，是一种高敏感度与高分辨率的显微镜，在生命科学领域的组织、细胞和分子水平研究中的应用十分广泛，主要用于样品荧光定量检测、共聚焦图像分析、三维图像重建、活细胞动力学参数分析和细胞间通信等方面研究。

LSCM的工作原理主要包含两个技术，即共聚焦技术和激光扫描技术。

（一）共聚焦技术

共聚焦指激发光路和发射光路在两个位置上聚焦。点光源发出的光通过照明针孔（或称光栅针孔）形成点光源，在荧光标记标本的焦平面上逐点扫描，并在样品中激发出荧光。采集点的荧光由物镜收集并通过分光镜会聚到探测针孔由探测器检测。由于共焦针孔、点光源、物镜焦面处于共轭位置，非焦面的荧光和杂散光被探测针孔阻挡。通过逐点扫描工作台上的样品，便可得到样品的荧光图像。由针孔限制仪器在样品表面的聚焦深度，有效防止杂质信号（如灰尘荧光、样品背面的污染、玻璃的荧光信号、扫描仪光学组件的荧光污染）产生的背景噪音干扰，从而降低背景信号的强度。(https://www.daowen.com)

（二）激光扫描技术

在共聚焦技术的基础上，采用激光扫描技术实现对样品的二维扫描成像，即在光路中安装两个检流镜，其转动角度可控制，分别用于控制光束对样品进行X轴方向和Y轴方向的逐点扫描成像，以获得样品某个深度的共聚焦图像，改变载物台的轴向（Z轴方向）位置，并获得一系列样品不同深度的共聚焦图像，即可在不破坏样品的情况下对样品进行三维重建，实现样品的三维观察。LSCM的X轴方向和Y轴方向分辨率接近于普通显微镜的2倍，Z轴方向分辨率可达到几百纳米。虽然如此，但由于共探测针孔抑制了绝大部分的杂散光，探测器检测的信号很微弱，高灵敏度的光电倍增管作为探测器起到放大信号的作用。

近些年来，不断有新的显微镜技术或相关技术与共聚焦探测方法联合应用，出现了几种视频LSCM。这类LSCM可以15Hz～30Hz的速率，扫描大于480帧的图像。其采取的改进措施有台阶扫描与镜扫描相结合的双向扫描技术、狭缝式分光与共聚焦孔径相结合的狭缝共聚焦孔径扫描技术、声光调制技术、共鸣检流技术等。其中计算机控制的声光调制技术（声光调制器，AODs）可对细胞的极小区域作毫秒级的瞬间激光脉冲扫描，瞬时分辨率大大增加，较好地解决了荧光漂白、淬灭等问题。