组织细胞培养的基本操作和技术
（一）细胞培养的无菌操作
1.无菌室
无菌室一般由更衣间、缓冲间、操作间3部分组成。为保持无菌状态，无菌室的消毒和防污染是非常必要的。通常采用每日（使用前）紫外照射（1～2h），每周甲醛、乳酸、过氧乙酸熏蒸（2h）和每月新洁尔灭擦拭地面和墙壁1次的方式进行消毒。实际工作中，要根据无菌室建筑材料的差异来选择合适的消毒方法。
2.超净工作台
原理是采用鼓风机驱动空气通过高效过滤器，使空气净化，净化的空气吹入台面空间，将其中的尘埃、细菌甚至病毒颗粒带走，使工作区呈无菌环境。超净工作台的平均风速保持在0.32～0.48m/s左右，过大、过小均不利于保持净化度；使用前最好开启超净工作台内紫外灯照射10～30min，然后让超净工作台预工作10～15min，以除去臭氧，并使工作台面空间呈净化状态；使用完毕后，要用70%乙醇将台面和台内四周擦拭干净，以保证超净台无菌。
3.常用培养器皿及清洗消毒
细胞培养需要大量消耗性物品，如玻璃器皿、金属器皿、塑料、橡胶制品、布类、纸类等。离体条件下，有害物质可以直接同细胞接触，培养器皿中极少量的残留物均可对细胞产生毒副作用。因此，新的或重新使用的器皿都必须认真清洗，达到不含任何残留物的要求。此外，微生物污染是造成细胞培养失败的主要原因，目前有多种用于细胞培养的消毒灭菌方法，每种方法都有一定的适应范围。通常采用过滤除菌系统、紫外照射、电子杀菌灯、乳酸、甲醛熏蒸等方法消毒实验室空气，采用新洁尔灭消毒实验室地面，采用高温干热灭菌、高温湿热灭菌、消毒剂浸泡、紫外照射等方法消毒培养用器皿，采用高压蒸汽灭菌或过滤除菌方法消毒培养液。
（二）细胞培养基本操作技术
1.细胞分离技术
将组织块分离（散）成细胞悬液的方法有多种，最常用的是机械解离细胞法、酶学解离细胞法以及螯合剂解离细胞法。
组织取材之后，最好立即培养。因故不能培养时，应把组织切成1mm3左右的小块，置于培养液中，4℃贮存；存放时间不宜超过24h。应严格保持无菌，也要避免受到紫外线照射或接触任何化学试剂及有害药物。为减少污染，对肿瘤组织或其他病理组织，可用含有500～1000U/mL青霉菌、链霉素的平衡盐溶液。漂洗5～10min后再做培养处理。
（1）机械解离细胞法
机械解离细胞法有切割分离法和机械分散法2种。需先将组织剪成小块，切割分离法是用手术刀切割或剪刀剪切成1mm3左右的组织块；机械分散法是把组织放入注射器针管中挤压或把组织置于不锈钢沙网中用钝器压取。
（2）酶学解离细胞法
酶学解离细胞法是在把组织剪成较小体积的基础上，应用生化和化学手段进一步分散组织的方法。最终使被处理的组织分散成细胞团或单个细胞，加入培养液制成细胞悬液，接种至培养器皿中进行培养。
①胰蛋白酶（Trypsin）法
去除不需要的组织，使用无菌的解剖刀和剪刀把剩余的组织切成3～4mm小片，将组织碎片悬浮在无钙、镁的平衡盐溶液中充分清洗。沉淀组织碎片，去除上清液，重复清洗2至3次。将盛有组织碎片的容器置于冰上，去除残留的上清液。再加入0.25%溶解在无钙、镁的平衡盐溶液中的胰蛋白酶（100mg组织加入1mL胰蛋白酶），4℃孵育6～18h，移弃组织碎片中的胰蛋白酶，37℃孵育20～30min，在组织碎片中加入预热的完全培养基，用移液管轻轻地分散组织。通过无菌不锈钢丝网（100～200mm）过滤，分散所有剩余组织。计数和接种细胞，进行培养。
②胶原酶（Collagenase）法(https://www.daowen.com)
用无菌解剖刀和剪刀把剩余组织切成3～4mm小片，用Hanks平衡液（HBSS）清洗组织碎片几次。加入胶原酶（50～200U/mL，溶解在HBSS中），37℃孵育4～18h，同时加入3mmol/L CaCl2增强解离效率。通过无菌不锈钢丝网或尼龙网过滤细胞悬液，以分离分散细胞、组织碎片和较大的碎片。如需进一步解聚，可在碎片中加入新鲜的胶原酶重复以上步骤。通过离心法在HBSS中清洗细胞悬液数次，使用培养基重悬细胞，计数和接种细胞，进行培养。
2.细胞计数法
培养的细胞在一般条件下要求有一定的密度才能生长良好，所以要进行细胞计数。当待测细胞悬液中细胞均匀分布时，通过测定一定体积悬液中的细胞数目，即可换算出每毫升细胞悬液中的细胞数目。细胞计数的原理和方法与血细胞计数相同。
3.细胞的冻存与复苏
目前通常采用低温液氮冻存法贮存细胞。细胞在液氮中，温度达到-196℃，贮存时间几乎是无限的。用时解冻，细胞仍能生长增殖。
低温液氮冻存的基本原理：在－70℃以下时，细胞内的酶活性均已停止，即代谢处于完全停止状态，故可以长期保存。在不添加保护剂的条件下冻存细胞时，细胞内外环境中的水会结成冰晶，导致细胞死亡。但如果向细胞培养液中加入保护剂甘油或二甲基亚砜（DMSO），可使冰点降低，在缓慢的冻结条件下，能使细胞内水分在冻结之前透出细胞外。细胞低温保存的关键在于通过0～20℃阶段的处理过程，在此温度范围内，水晶呈针状，极易导致细胞的严重损伤。标准的冷冻速度为-1℃～-12℃/min，当温度下降到-25℃时，冷冻速度可增至-5～-10℃/min；当达到-100℃时则可迅速冻入液氮中。
冻存细胞的复苏：冻存的细胞较脆弱，因此要轻柔操作。冻存细胞要快速融化，并直接加入完全生长培养基中。若细胞对冻存剂（DMSO或甘油）敏感，可离心去除冻存培养基，然后加入完全生长培养基中。
4.细胞运送
选生长状态良好的细胞，待达到80%或90%汇合时，去掉旧培养液换入新培养液，量要达到培养瓶的颈部（过满易污染），保留少许空间，塞紧瓶塞；如空气过多，运输中气泡运动易使细胞脱落。妥善包装和运送：一般在不超过5天到达目的地的情况下，对细胞活力无严重影响；到达后，倒出大部分培养液，保留正常量，置37℃培养，次日传代。
5.细胞的生长阶段及形态特征观察
传代培养的细胞需每日进行观察，注意细胞有无污染、培养液颜色的变化及细胞生长的情况。细胞生长一般要经过以下3个阶段：
（1）潜伏期（latent phase）
细胞接种培养后，先经过一个在培养液中呈悬浮状态的悬浮期。此时细胞质回缩，胞体呈圆球形。接着是细胞附着或贴附于底物表面上，称贴壁，悬浮期结束。各种细胞贴附速度不同，这与细胞的种类、培养基成分和底物的理化性质等密切相关。初代培养细胞贴附慢，时间可长达10～24h或更长时间；连续细胞系和恶性细胞系快，10～30min即可贴附。细胞贴附是一个非常复杂且与多种因素相关的过程。贴附是贴附类细胞生长、增殖条件之一，细胞贴附于支持物后，先经过前述延展过程变成极性细胞，还需经过一个潜伏阶段，进入生长和增殖期。细胞处在潜伏期时，可有运动活动，基本无增殖，少见分裂象。细胞潜伏期与细胞接种密度、细胞种类和培养基性质等密切相关。初代培养细胞潜伏期长，约24～96h或更长时间，连续细胞系和肿瘤细胞潜伏期短，仅6～24h；细胞接种密度大时潜伏期短。当细胞分裂象开始出现并逐渐增多时，标志细胞已进入指数增生期。
（2）指数增生期（logarithmic growth phase）
这是细胞增殖最旺盛的阶段，细胞分裂象增多。指数增生期细胞分裂象数量可作为判定细胞生长旺盛与否的一个重要标志。一般以细胞分裂指数（Mitotic Index：MI）表示，即细胞群中每1000个细胞中的分裂象数。体外培养细胞分裂指数受细胞种类、培养液成分、pH、培养箱温度等多种因素的影响。一般细胞的分裂指数介于0.1%～0.5%，初代细胞分裂指数低，连续细胞和肿瘤细胞分裂指数可高达3%～5%。指数增生期是细胞一代中活力最好的时期，因此是进行各种实验最好的和最主要的阶段。在接种细胞数量适宜情况下，指数增生期持续3～5天后，随细胞数量不断增多、生长空间渐趋减少，最后细胞相互接触汇合成片。细胞相互接触后，如培养的是正常细胞，由于细胞的相互接触能抑制细胞的运动，这种现象称接触抑制（contact inhibition）。而肿瘤细胞则无接触抑制现象，因此接触抑制现象可作为区别正常细胞与肿瘤细胞的标志之一。肿瘤细胞由于无接触抑制能继续移动和增殖，导致细胞向三维空间扩展，使细胞发生堆积（piled up）。细胞接触汇合成片后，虽发生接触抑制，只要营养充分，细胞仍然能够进行增殖分裂，因此细胞数量仍在增多。但当细胞密度进一步增大，培养液中营养成分减少，代谢产物增多时，细胞因营养的枯竭和代谢物的影响，则发生密度抑制（density inhibition），导致细胞分裂停止。因此细胞接触抑制和密度抑制是两个不同的概念，不应混淆。
（3）停滞期（stagnate phase）
细胞数量达饱和密度后，细胞停止增殖，进入停滞期。此时细胞数量不再增加，故也称平顶期（plateau）。停滞期细胞虽不增殖，但仍有代谢活动，继而培养液中营养渐趋耗尽，代谢产物积累、pH 降低。此时需做分离培养即传代，否则细胞会中毒，发生形态改变，甚至从底物脱落死亡，故传代越早越好。传代过晚（已有中毒迹象）能影响下一代细胞的机能状态。在这种情况下，虽进行了传代，因细胞已受损，需要恢复，至少还要再传1～2代，通过换液淘汰掉死细胞和使受损轻微的细胞得以恢复后，才能再使用。