细菌的分离培养
（一）需氧性细菌分离培养法
1.琼脂平板划线分离法
菌种被其他杂菌污染时或临床分离鉴定检验标本（粪、痰、脓汁等）常用平板划线法进行纯种分离，此法是借助将蘸有混合菌悬液的接种环在平板表面多方向连续划线，使混杂的微生物细胞在平板表面分散，经培养得到分散的由单个微生物细胞繁殖而成的菌落，从而达到纯化目的。划线分离的培养基必须预先倾注好，充分冷凝待平板稍干后才可使用；为便于划线，一般90mm平皿约倾注20mL培养基，培养基应厚薄均匀，平板表面光滑。划线分离主要有连续划线法和分区划线法（如图1.2.8-1）2种。
图1.2.8-1 平板划线分离法
（1）连续划线法
以无菌操作用接种环直接取平板上待分离纯化的菌落，将菌种点种在平板边缘一处，取出接种环，火焰灭菌烧去多余菌体。将接种环再次通过稍打开皿盖的缝隙伸入平板，在平板边缘空白处接触一下使接种环冷却，然后从接种细菌的部位在平板上自左向右轻轻划线，划线时平板面与接种环面呈30～40°角，以手腕力量在平板表面轻巧滑动划线，接种环不要嵌入培养基内划破培养基，注意勿使前后2条线重叠。划线完毕，关上皿盖。灼烧接种环，待冷却后放置接种架上。培养皿倒置于适宜的恒温箱内培养。培养后在划线平板上观察沿划线处长出的菌落形态，涂片镜检为纯种后再接种斜面。
（2）分区划线法
取菌、接种、培养方法与“连续划线法”相似。分区划线法分离时平板分4个区，故又称4分区划线法。其中第4区是单菌落的主要分布区，故其划线面积应最大。为防止第4区内线条与第1、2、3区线条相接触，应使第4区线条与第1区线条相平行，这样区与区间线条夹角最好保持120°左右。先将接种环蘸取少量菌在平板上第1区划3～5条平行线，取出接种环，左手关上皿盖，将平板转动60～70°。灼烧接种环，待在平板边缘上冷却后，再按以上方法以第1区划线的菌体为菌源，由第1区向第2区做第2次平行划线。第2次划线完毕，同时再把平皿转动约60～70°，同样依次在第3区、第4区划线。划线完毕，灼烧接种环，关上皿盖，倒置于37℃恒温箱中培养18～24h后，在划线区观察单菌落。
2.琼脂平板涂布分离法
被检病料如血液、腹水等，可用灭菌毛细吸管或吸管吸取1～2滴置于平板中央，用灭菌的L 形玻棒做均匀涂布。如估计细菌数很多，可直接用火焰灭菌的接种环钓菌，并做分区划线。如为脏器病料，可先做成乳悬液再行涂布；或取其一小块，用镊子夹住，表面烧烙后，用灭菌刀切开，以其切面直接进行涂布，此法适用于含菌量较少的标本分离。
3.倾注平皿分离法
被检标本含有混杂细菌，可借助融化的琼脂将细菌稀释，待琼脂冷凝后，分散的细菌就被固定在原地形成菌落，这样也能达到分得纯种的目的。根据材料中存在菌数的多少，倾注平皿前可将被检标本不稀释或用生理盐水做适当稀释。其具体方法如下：
取3支预先准备的普通琼脂培养基试管，水浴加热融化，冷至约50℃，用火焰灭菌接种环钓取待分离物接种至第1管内，充分摇匀后，自第1管取1接种环内容物至第2管，以同样方法自第2管移种至第3管。然后分别倾注于1个已灭菌的平皿，凝固后倒转置于37℃培养箱内培养18～24h。结果多数细菌在琼脂内生长成菌落，仅少数菌落出现在表面，通常第1个平板内的菌落数较多而密集，第2、3个平板则逐渐减少，可见单个菌落。
4.琼脂斜面分离法
取琼脂斜面3管，用接种环蘸取欲检病料少许（如为脏器，先将表面烧烙后，用灭菌解剖刀切开，以灭菌接种环由切口插入、转动，钓取组织），混合于第1管的凝集水中，再做斜面划线；然后抽出接种环，不经烧灼，继续在第2管、第3管斜面上做同样划线。划毕，置37℃温箱中培养。经此法分离培养后，第2管的菌落较第1管少，第3管的菌落更少，如此较易得到单个菌落，达到纯培养之目的。
5.营养肉汤分离法
当被检标本中含病原菌少，或有抗生素残留时，用上述琼脂斜面或平板分离法可能无菌落长出，这时可以无菌操作剪取一小块标本直接投入肉汤，经37℃培养，在肉汤中长出细菌后，再用琼脂斜面或琼脂平板分离。
6.芽胞需氧菌分离培养法
如果被检标本中可疑有带芽胞的细菌，可先将被检标本加少量生理盐水或肉汤，置于80℃水浴箱中15～20min，或85℃加热10min，再进行培养。标本中若有带芽胞的细菌仍可存活而生长繁殖，不耐热的细菌繁殖体则被杀灭。
7.利用化学药品分离培养法
（1）抑菌作用：有些药品对某些细菌有极强的抑制作用，而对另外一些细菌没有抑制作用，因此可利用这种特性进行细菌的分离。例如通常在培养基中加入结晶紫或青霉素等化学药品来抑制革兰阳性菌的生长，以分离得到革兰阴性菌。
（2）杀菌作用：将病料如结核病料用15%硫酸溶液处理，其他杂菌均被杀死，而结核分枝杆菌因具有抗酸性而存活。
（3）鉴别作用：利用细菌对某种糖的分解能力，通过培养基中指示剂的变化来鉴别某种细菌。例如远藤氏培养基可以用来鉴别大肠埃希菌与沙门氏杆菌。
8.实验动物分离法
被检病料中疑有某种病原菌存在，可将病料以无菌操作取出，放入灭菌乳钵或组织匀浆器内，加3～5倍量无菌生理盐水制成混悬液，吸取一定量混悬液注射（肌肉注射、腹腔注射、皮下注射或静脉注射）入易感实验动物，待实验动物死后，取其脏器，常可分离到纯的病原菌。例如，疑有猪丹毒杆菌存在的病料，可注射于鸽体，鸽死后，再取其脾脏以分离猪丹毒杆菌，可得到纯培养。
（二）厌氧性细菌分离培养法
细菌接种后，直接放在恒温箱内培养，可以使需氧菌与兼性厌氧菌生长繁殖；但对于厌氧菌，则需将培养环境或培养基中的氧气除去，或将氧化性物质还原，降低其氧化还原电势，才能生长繁殖。在有氧的环境下，培养基的氧化还原电势较高，不适于厌氧菌的生长。为使培养基电势降低，降低培养环境的氧分压是十分必要的。现有的厌氧培养法很多，主要介绍以下几种。
1.厌氧罐培养法
厌氧罐是一种小型的培养厌氧菌的密封容器，培养技术于1916年问世，大体经历了一个简便化、高效化、安全化、规格化和商品化的演变过程，需要产气系统、催化系统、厌氧指示剂系统和吸湿系统形成厌氧环境条件。使厌氧罐达到无氧状态有多种方法，例如用抽气换气法以氮或二氧化碳驱除罐内氧气。在各种不同的除氧方法中，获得最迅速发展和广泛使用的是利用含钯（或铂）的常温催化剂使氢与氧化合成水，使罐内氧气全部消失。
2.厌氧袋培养法
根据氢“燃烧”除氧的原理所设计的一种简易透明、不透气的塑料袋，配有产气、催化、厌氧度指示及吸湿4个系统，建立厌氧条件。利用氢硼化钠（NaBH4）或氢硼化钾（KBH4）与水反应产生氢，氢与密封袋中的氧气在钯催化下结合成水，从而建立起无氧小环境，厌氧袋中二氧化碳由枸橼酸和碳酸氢钠反应生成，利用亚甲蓝的变色反应作为厌氧度的指示剂。
3.厌氧手套箱法
随着对厌氧菌认识和研究的不断深入，为了更好地适应对厌氧菌的生理、生化和生态研究的需要，开发出多功能化的厌氧培养设备——厌氧手套箱系统。厌氧手套箱系统也具有前述厌氧培养的4个系统来形成和维持厌氧环境，并做了改进，从而使其确保了比传统厌氧罐或厌氧袋更严格的厌氧环境，能在其工作箱中进行高质量的厌氧菌的分离、纯化、培养，且易观察，通过袖式裸手操作系统和快速气闸转移系统可快速操作和分离厌氧菌。
4.生物学方法(https://www.daowen.com)
培养基中含有植物组织（马铃薯、燕麦、发芽谷物等）或动物组织（新鲜动物组织小片，或加热的肌肉、心、脑等），因组织的呼吸作用，以及组织中可氧化物质的氧化而消耗氧气（肌肉、脑磷脂中不饱和脂肪酸的氧化，碎肉培养基的应用），造成厌氧环境，以利于厌氧性细菌的生长、繁殖。同时，组织中所含的还原性化合物（谷胱甘肽）也可使氧化-还原电势下降。
此外，将厌氧菌与需氧菌共同培养在同一环境中，则环境中的氧被需氧菌消耗，造成厌氧环境，也有利于厌氧菌的生长、繁殖。
（1）动物组织及其他物质加入法：在液体培养基内加入肝脏、肾脏等动物脏器，因其中的半胱氨酸的—SH极不稳定，为强还原剂，所以可利用此培养基进行厌氧培养，在培养之前将肝片肉汤加热，以驱出空气，冷却，然后接种培养。
（2）共栖培养法：将厌氧菌与需氧菌共同培养在同一个平皿内，利用需氧菌的生长、繁殖将氧气消耗后，造成厌氧环境利于厌氧菌生长。其具体方法是将培养皿的一半接种消耗氧气能力极强的需氧菌如大肠埃希菌、枯草芽胞杆菌等，另一半接种厌氧菌，接种后将平皿倒扣在一块玻璃板上，并用石蜡密封，置37℃恒温箱中培养2～3d，即可观察到需氧菌和厌氧菌先后生长。
5.其他化学方法
利用还原能力强的化学物质，将环境或培养基内的氧气消耗，或还原氧化型物质，降低氧化-还原电势。
（1）焦性没食子酸法
焦性没食子酸在碱性溶液内能大量地吸收氧而造成厌氧环境，有利于厌氧菌的生长、繁殖。通常100cm3空间用焦性没食子酸1g及10%氢氧化钠或氢氧化钾10mL。介绍下列几种方法：
①平板培养法
将厌氧菌划线接种于适宜的琼脂平板，取一小团直径约2cm的脱脂棉，置于平皿盖的内面中央，其上滴加0.5mL10%氢氧化钠溶液；在靠近脱脂棉的一侧放置0.5g焦性没食子酸，暂勿使两者接触。立即将已接种的平板覆盖于平皿盖上，迅速用融化的石蜡密封平皿四周。封毕，轻轻摇动平皿，使被氢氧化钠溶液浸湿的脱脂棉与焦性没食子酸接触，然后置37℃恒温箱中培养24～48h后，取出观察。
②Buchner氏试管法
取一大试管，在管底放焦性没食子酸0.5g及玻璃珠数个或放一螺旋状铅丝。将已接种的培养管放入大试管中，迅速加入2%NaOH溶液0.5mL，立即将试管口用橡皮塞塞紧，必要时周围用石蜡密封。37℃培养24～48h后观察（如图1.2.8-2-A）。
③瑞氏厌氧培养法
将已接种细菌的培养管的脱脂棉棉塞在火焰中灼烧灭菌后，塞入管中离培养基1～1.5cm处，置适量焦性没食子酸于其上，加入10%NaOH溶液2mL，迅速用橡皮塞将管口塞紧，以胶泥或石蜡严密封闭置温箱中培养（如图1.2.8-2-B）。
④史氏厌氧培养法
用厌氧培养皿，在皿底一边置焦性没食子酸，另一边置NaOH溶液，将已接种的平皿翻盖于皿上，并将接合处用胶泥或石蜡密封，然后摇动底部，使氢氧化钠与焦性没食子酸混合，置温箱中培养。
⑤平皿厌氧培养法
置一片中有小圆孔的金属板于两平皿之间，上面的平皿接种细菌，下面的平皿盛焦性没食子酸及氢氧化钠溶液，用胶泥封闭后置温箱中培养。
⑥玻罐或干燥器法
置适量焦性没食子酸于一干燥器或玻璃罐的隔板下面，将培养皿或试管置于隔板上，并在玻璃罐内置亚甲蓝指示剂一管，从罐侧加入氢氧化钠溶液于罐底，将焦性没食子酸用纸或纱布包好，用线系住，暂勿与氢氧化钠接触，等一切准备好后，将线放下，使焦性没食子酸落入氢氧化钠溶液中，立即将盖盖好，密封，置温箱中培养。
图1.2.8-2 焦性没食子酸法
（2）连二亚硫酸钠法
利用连二亚硫酸钠（sodium hydrosulfite）和碳酸钠以吸收空气中的氧气，释放二氧化碳造成厌氧环境：
Na2S2O4+Na2CO3+O2=Na2SO4+Na2SO3+CO2
取一有盖的玻璃罐，罐底垫一薄层棉花，将接种好的平皿重叠正放于罐内（如是液体培养基，则直立于罐内），最上端保留可容纳1～2个平皿的空间（视玻璃罐的体积而定），按玻璃罐的体积每1000cm3空间用连二亚硫酸钠及碳酸钠各30g，在纸上混匀后，盛于上面的空平皿中，加水少许使混合物潮湿，但不可过湿，以免罐内水分过多。若用无盖玻璃罐，可将平皿重叠正放在浅底容器上，以无盖玻璃罐置于皿上，罐口周围用胶泥或水银封闭。
（3）硫乙醇酸钠法
硫乙醇酸钠是一种还原剂，加入培养基中，能除去其中的氧或还原氧化性物质，促使厌氧菌生长。其他可用的还原剂包括葡萄糖、维生素C及半胱氨酸等。
①液体培养基法
将细菌接入含0.1%的硫乙醇酸钠液体培养基中，并加入亚甲蓝溶液作为氧化还原的指示剂，37℃培养24～48h后观察，在无氧条件下，亚甲蓝被还原成无色。
②固体培养基法
用Brewer厌氧菌培养皿，可使厌氧菌在培养基表面生长而形成孤立的菌落。具体方法如下：先将Brewer培养皿干热灭菌，将融化冷却至50℃左右的硫乙醇酸钠固体培养基倾入皿内。待琼脂冷凝后，将厌氧菌接种于培养基的中央部分。盖上皿盖，使皿盖内缘与培养基外围部分相互紧密接触。此时皿盖与培养基中央部分留在空隙间的氧气被硫乙醇酸钠还原，亚甲蓝指示剂逐渐褪色，而外缘部分，因与大气相通，仍呈蓝色。将Brewer氏培养皿于37℃恒温箱内24～48h后观察。
（三）兼性厌氧菌的分离培养方法
对人和动物致病的大多数病原菌属于兼性厌氧菌，最常用的是二氧化碳培养法——烛缸法：将接种细菌的培养基置玻璃干燥器或其他可以密闭的玻璃缸内，在其内点燃一小段蜡烛，加上盖（盖边涂上凡士林以防漏气），约1min蜡烛自然熄灭，此时缸内氧气已被消耗，缸内所含二氧化碳约为5%～10%。除燃烧耗氧法也可用化学物质作用生成二氧化碳气体，如碳酸氢钠与硫酸钠。