三、核型分析
（一）非显带染色体显微镜下核型分析
取人类非显带染色体玻片放到显微镜下，先用低倍镜寻找染色体分散良好的中期分裂象，再转换油镜仔细观察，计算一定数量的细胞（30～50个分裂象），初步判断绝大部分的细胞染色体是46条以后，再进一步验证这些具有46条染色体的细胞呈正常二倍体还是假二倍体。如果在观察中发现一些细胞的染色体数目增多或减少，或者有结构上的畸变时，便需在显微镜下进行初步配对分析。其方法是按照ISCN规定标准，将所分析的分裂象中的染色体直接用笔或显微描绘器，尽量按每条染色体所处的自然位置，如实地画出草图而进行配对分析。
配对分析时，主要是根据显微镜下所看到的各染色体特点（大小，着丝粒位置）一一在所画图上标上染色体或组别。在非显带的标本中，一般对各组间的区分是可以达到的，但对组内各对的区分，特别是C组内各对染色体的区分是很困难的，所以配对分析时，除第1、2、3、16和Y染色体，其他组内各染色体号是难以准确标出的。同时，一般除性畸形病例外，根据G组染色体数目是4条还是5条，即可初步确定该核型是XX还是XY。
（二）正常人非显带染色体特征及识别
分裂中期的染色体构造典型，便于分析。中期染色体已纵裂为两个染色单体，从着丝粒向两端就是染色体的“两臂”，可将染色体分隔成短臂（p）和长臂（q），根据着丝粒位置的不同可以将染色体分为中央着丝粒染色体（M）、亚中着丝粒染色体（SM）、近端着丝粒染色体（ST）。除去着丝粒以外，有时还能看到次缢痕。对任一个染色体的基本形态学特征来说，重要的参数有四个。
1.相对长度
相对长度指单个染色体的长度与包括X染色体在内的单倍体染色体总长度之比，以百分率或以千分率表示。
2.臂指数
臂指数指长臂同短臂的比率。即：
臂指数=长臂的长度/短臂的长度
按Levan的标准划分：臂指数在1.0～1.7之间为中着丝粒染色体；在1.7～3.0之间为亚中着丝粒染色体；在2.0～7.0之间的为近端着丝粒染色体。
3.着丝粒指数
着丝粒指数指短臂占整个染色体长度的比例，它决定着着丝粒的相对位置，按Levan 的划分标准，着丝粒指数在50.0～37.5之间为中着丝粒染色体，在37.5～25.0之间为亚中着丝粒染色体，在25.0～12.5之间为近端着丝粒染色体。
4.染色体臂数（NF）
是根据着丝粒的位置来确定，着丝粒位于染色体端部，称为端部着丝粒染色体，其臂数可作为一个，当着丝粒位于染色体的中部，那么染色体的臂数可计为两个。
在非显带的吉姆萨染色体标本上显示的人类染色体核型各组特点，如表1.2.9所示。
表1.2.9 人类染色体核型中染色体特征（参数）
（三）正常人G显带染色体的带型特征
各组染色体带型识别要点如下：
A组：包括1～3号3对染色体。
1号：着丝粒和副缢痕着色浓。
p：在中期显示320条带左右的分裂象标本上，近侧段有2条深带，第二条深带稍宽，在显带较好的标本上，远侧段可显现3～4条浅染的深带。此臂分为3个区：近侧的第一条深带为1p21；第二条深带为1p31。
q：副缢痕紧贴着丝粒，着色浓。其远侧为1宽的浅带，近中段与远侧段各有2条深带，中段的第二条深带染色较浓，中段2条深带稍靠近。此臂分为4个区：副缢痕远侧的浅带为1q31；远侧段第一深带为1q41。
2号：着丝粒染色浅。
p：有4条深带，中段2条深带稍靠近。此臂分成2个区：中段2条深带之间浅带为2p21。
q：有4～7条深带，第三条深带和第四条深带有时融合。此臂分为3个区：第二条深带和第三条深带之间的浅带为2q21；第四条深带和第五条深带之间的浅带为2q31。
3号：着丝粒染色较浓。在p和q的近中段各有1条明显的宽带。
p：约有3～4条深带。近侧段可见1条较宽的深带，远侧段可见2条深带，其中远侧的1条较窄，且着色深，这是区别第3号染色体短臂的特征，在显带较好的标本上，近侧段的深带可分为2条深带。此臂分为2个区：中段浅带为3p21。
q：一般近侧段和远侧端各有1条较宽的深带，在显带较好的标本上，近侧段的深带可分为2条深带，远侧段深带可分为3条深带。此臂可分为2个区：中段浅带为3q21。
B组：包括4～5号2对染色体，着丝粒约在1/4处。
4号：
p：有2条深带，近侧的深带较浅，短臂只有1个区。
q：可见均匀分布的4条深带。此臂分为3个区：近侧段的第一条深带和第二条深带之间的浅带为4q21；远侧段2条深带之间的浅带为4q31。
5号：
p：有2条深带，远侧段的深带宽而色深，此臂只有1个区。
q：近侧段有2条深带，着色较淡，有时不明显。中段有3条深带，染色较深，有时融合成1条宽深带，这是辨认该号染色体的特征之一。远侧段有2条深带，末端的1条着色深。此臂分为3个区：中段第二条深带为5q21；中段后1条深带与远侧段深带之间宽阔的浅带为5q31。
C组：包括6～12号和X染色体。
6号：
p：中段有1条明显而宽阔的浅带，形如“小白脸”。近侧段和远侧段各有1条深带，近侧深带紧贴着丝粒。在显带较好的标本中，远侧段的深带可再分为2条深带。此臂分为2个区：中段明显宽的浅带为6p21。
q：有5条深带，近侧段1条紧贴着丝粒。远侧段末端1条深带着色较淡。此臂分为2个区：第二条深带与第三条深带之间的浅带为6q21。
7号：着丝粒染色较深。
p：有3条深带。有时中段深带色淡而不明显。远侧为着色较深的深带，形似“瓶盖”。此臂分为2个区：远侧深带（端粒带）为7p21。
q：有3条明显深带。远侧近末端的1条深带着色较淡，第二条深带和第三条深带稍有接近。此臂分为3个区：近侧的第一条深带为7q21；中段的第二条深带为7q31。
8号：
p：有2条深带，中段有1条较明显的浅带，这是与第10号染色体鉴别的主要特征之一。此臂分为2个区：中段的浅带为8p21。
q：可见3条界线不明显的深带，远侧深带着色较深，这是与第7号染色体鉴别的特征之一。此臂分为2个区：中段的深带为8q21。
9号：着丝粒染色较浓。
p：近侧和中侧段各有1条深带，显带较好的标本中，中段可见2条较窄的深带。此臂分为2个区：中段的深带为9p21。
q：可见2条明显的深带。副缢痕不着色，在有些标本上呈现出特有的狭长的颈部。此臂分为3个区：近侧的1条深带为9q21；远侧的1条深带为9q31。
10号：着丝粒着色较深。
p：近侧段和近中段各有1条深带，但不如第8号染色体短臂的2条深带分界清晰。此臂只有1个区。
q：可见明显的3条深带。近侧深带较明显，远侧的2条深带较靠近，这是与第8号染色体相鉴别的主要特征之一。此臂分为2个区：近侧段的1条深带为10q21。
11号：
p：近中段可见1条深带，在显带好的标本上，这条深带可分为3条较窄的深带。此臂只有1个区。
q：近侧有1条深带，紧贴着丝粒。远侧段有1条明显的深带，这条深带与近侧的深带之间有1条宽阔的浅带，这是与第12号染色体相鉴别的一个明显特征。在显带较好的标本上，远侧段的这条较宽深带可分为2个较窄的深带，2深带之间有1条很窄的浅带，一般极难辨认，但它是分区的一个界标。有些标本可见端粒处有1条窄的色淡的深带。此臂分为2个区：上述远侧的两条深带之间的那条很窄的浅带为11q21。
12号：
p：中段有1条深带。此臂只有1个区。
q：近侧段有1条深带，紧贴着丝粒。中段有1条宽的深带，其与近侧的深带之间有1条明显的浅带，但与第11号染色体相比，此浅带较窄。这是鉴别第11、12号染色体的特征。显带好的标本中，中段的这条较宽的深带分为3条。正中1条着色较深。在远侧段有的能看到1～2条染色较淡的深带。此臂分为1个区：中段正中的深带为12q21。
D组：包括13～15号染色体。
13号：着丝粒区浓染。
q：有4条深带，第一条深带和第四条深带较窄色淡。第二条深带和第三条深带较宽，色深。此臂分为3个区：第二条深带为13q21；第三条深带为13q31。
14号：着丝粒区浓染。
q：近侧段和远侧段有1条明显的深带。在显带好的标本上，中段尚可见1条着色较淡的深带。此臂分为3个区：近侧深带为14q21；远侧深带14q31。
15号：着丝粒区深染。
q：中段有1条明显的深带，染色较浓。在有些标本上，在近侧段可见1～2条淡染的深带。此臂分为2个区：中段深带为15q21。
E组：16～18号3对染色体。第16号着丝粒约在3/8处。第17、18号着丝粒约在1/4处。
16号：
p：中段有1条深带。在显带较好的标本上可见2条深带。此臂只有1个区。
q：中段和远侧段各有1条深带，有时远侧的不明显。副缢痕着色浓，具有多态性，变异较大。此臂分为2个区：中段的深带为16q21。
17号：
p：有1条深带，紧贴着丝粒。此臂只有1个区。
q：远侧段可见1条明显的深带，这条深带与着丝粒之间有1条明显宽阔的浅带。此臂分为2个区：这条明显宽阔的浅带为17q21。
18号：
p：一般为浅带，此臂只有1个区。
q：近侧和远侧各有1条明显的深带。此臂分为2个区：2条深带之间的浅带为18q21.
F组：19～20号染色体。
19号：
着丝粒及其周围为深带，其余为浅带。p和q各有1个区。
20号：着丝粒区深染。
p：有1条明显的深带。此臂只有1个区。
q：在中段和远侧段可见1～2条深带，但色较淡，有时全为浅带。此臂只有1个区。
G组：21～22号和Y染色体。
21号：着丝粒区着色淡，长度比22号短。
q：近侧段有1条明显的宽带。此臂分为2个区：其深带为21q21。
22号：
q：有2条深带，近侧的1条深带紧贴着丝粒，着色浓。近中段的1条深带着色淡，有时不出现。此臂只有1个区。
Y染色体：为近端着丝粒染色体，一般情况下比第21、22号染色体长，但其长度变化较大。在长臂的远侧段1/2处常浓染，有时整个长臂被染成深带，在显带较好的标本上，可见2条深带，此臂只有1个区。
X染色体：长度介于第7和第8号染色体之间。虽为亚中着丝粒染色体，但与其他C组的染色体相比，短臂较长。着丝粒在3/8处。
p：中段有1条明显的深带。犹如竹节状。在一些标本上，近侧段可见1条窄的、着色淡的深带。此臂分为2个区，中段的深带为Xp21。
q：可见4～5深带。近中部1条最明显。此臂分为2个区：近中段的深带为Xq21。
正常男性G显带核型模式如图1.2.9-2所示。
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图1.2.9-2 正常男性G显带核型模式图
附：染色体标本的制备方法
一、小鼠骨髓细胞染色体标本的制备
1.秋水仙素处理
取材前3～4h，按4μg/g体重的剂量向小鼠腹腔注射秋水仙素。
2.骨髓细胞收集
颈椎脱臼法处死小鼠，剥离出股骨及两侧的关节，剪去两端，暴露出骨髓腔，用注射器将预温至37℃的2mL0.075mol/L KCl溶液注入骨髓腔，并将冲洗液收集入刻度离心管中，反复数次，至骨髓腔变白为止，最终收集液不超过4mL。
3.低渗
吹打均匀后置37℃恒温水浴箱中静置25min，每隔10min用吸管吹打1次。
4.预固定
低渗后，加入新配制Garnoy固定液1mL，平衡后1500r/min转速离心10min。
5.固定
弃上清，加入新配制Garnoy固定液5mL，轻轻吹打均匀，静置20min，1500r/min转速离心10min。
6.再固定
依照上法重复固定1次。
7.滴片
吸去上清液，视管底细胞的多少加入少量固定液，轻轻吹打制成细胞悬液，在经冰水浴过的载玻片上滴2～3滴细胞悬液，滴片时由20～35cm处滴下，于酒精灯上温火烘干或用电吹风轻轻吹干。
8.染色
将玻片平放于支架上，用吸管吸取吉姆萨工作液1～2mL到玻片标本上，染色10min。自来水细水流冲洗。
9.观察
显微镜下观察和分析。
二、人类微量外周血淋巴细胞培养
1.采血
常规消毒被检者肘部皮肤，用一次性肝素钠真空采血管抽取肘静脉血1～1.5mL，转动采血管，使静脉血抗凝。
2.接种
在无菌室内或超净工作台上依照无菌操作要求将抽取的抗凝血滴入盛有5mL1640培养液的培养瓶内，每瓶接种1mL抗凝血，轻轻摇动以混匀。
3.培养
将培养瓶放入37℃恒温培养箱内培养72h，每隔24h轻轻混匀一次，在终止培养前3～4h将10μg/mL的秋水仙素100μL加入培养瓶内，轻轻摇匀，放回培养箱内，继续培养3～4h。
4.收获
（1）取出培养瓶，用吸管充分吹打瓶壁，将培养瓶内液体混匀，吸取培养物并将其移入5mL离心管中，平衡后放入离心机，以1500r/min转速离心8～10min，吸去上清液，留下沉淀物。
（2）低渗处理：往离心管中加入4mL预热至37℃的0.075mol/L KCl低渗液，用吸管打匀，使细胞悬浮于低渗液中，置于37℃恒温水浴箱内低渗20～35min，使白细胞膨胀，染色体分散，红细胞解体（低渗时间每个实验室均有差异，因室温培养细胞生长程度等因素而异，自行摸索精确的时间）。每隔10min用吸管吹打混匀1次。
（3）预固定：低渗处理完后，加入1mL新配制的固定液并混合均匀，平衡后1500r/min转速离心8～10min，吸去上清液，留下沉淀物。
（4）固定：加入5mL新配制的固定液，用吸管吹打充分混匀，室温下静置30min，平衡后1500r/min转速离心8～10min，吸去上清液，留下沉淀物。
（5）再固定：加入新配制的固定液5mL，用吸管充分混匀，室温下静置30min，平衡后1500r/min转速离心8～10min，吸去上清液，留下沉淀物。
（6）制片：视离心管中沉淀细胞的多少加入新配制的固定液0.5mL，混合均匀制成细胞悬液，用吸管吸取细胞悬液滴在经冰水浴的载玻片上，滴片时由20～30cm处滴下，每片滴2～3滴，用吹风机吹干。
（7）染色：将上述载玻片放入盛有10%吉姆萨染液的染色缸内染色10～15min，在自来水下用细水流轻轻冲洗，吹干，镜检。
三、G显带染色体标本的制备
1.胰蛋白酶法
（1）将常规制备的人染色体玻片（未染色的白片）置70℃烤箱中处理2h，然后转入37℃培养箱中备用，一般在第3～7d进行显带。
（2）取2.5%的胰蛋白酶液2.5mL加生理盐水至50mL配成0.125%的工作液并用NaHCO3调pH值至7左右。
（3）将配好的胰蛋白酶工作液放入37℃水浴箱中预热。
（4）将玻片标本浸入胰蛋白酶中，不断摆动使胰蛋白酶的作用均匀，处理1～2min（精确的时间自行摸索）。
（5）立即取出玻片，放入生理盐水中漂洗两次。
（6）染色，将标本浸入37℃预温的吉姆萨染液（1∶10的吉姆萨原液和pH6.8的磷酸缓冲液）中染色10min左右。
（7）自来水冲洗（用细水流小心冲洗），晾干。
（8）镜检显带效果。在低倍镜下选择分散良好长度适中的分裂相转换油镜观察，若染色体未出现带纹，则为显带不足；若染色体边缘发毛为显带过头，此时应根据具体情况增减胰蛋白酶处理时间重新处理一张标本。
2.EDTA-胰蛋白酶法
（1）取25mL生理盐水和25mL0.02%的EDTA溶液倒入立式染色缸中混匀。
（2）取2.5%的胰蛋白酶原液1mL加入到上液中混匀，并用5%NaHCO3调pH值至7左右。置水浴箱预温至37℃。
（3）将染色体标本片浸入胰蛋白酶-EDTA溶液中处理5～20s，同时轻轻摇动玻片。
（4）取出标本立即浸入生理盐水中洗2次。
（5）浸入37℃的吉姆萨染液中染色5～10min。
（6）自来水细水洗冲洗后晾干，镜检。
四、其他显带技术
人类染色体显带技术，除了G显带之外，还有以下几种显带技术。
1.Q显带
用荧光染料氮芥奎吖因处理染色体标本后，在荧光显微镜下，可观察到染色体沿其长轴显示出一条条宽窄不同的明亮相见的带纹，称为Q带。
2.R显带
用盐溶液处理染色体标本后，再用吉姆萨染液染色，显示与G带相反的带，称反带或R带。即G带的深染带部位R带为浅带，G带为浅带的部位R带则为深带。
3.T显带
将染色体标本加热处理后，再用吉姆萨染液染色可使染色体末端区段特异性深染，称T带。
4.C显带
用NaOH或Ba（OH）2处理标本后，再用吉姆萨染液染色，可使着丝粒和副缢痕的结构性异染色质部分以及Y长臂远侧深染。这些部位是染色体的多态性部位，因此，常用C带进行多态性亲源分析和额外异常染色体来源分析。
5.N显带
用硝酸盐染色可使染色体的随体及核仁形成区呈现出特异性的黑色银染物，又称为Ag-NOR。
五、注意事项
1.在采血或接种时，注意不要使用太多的肝素（100U肝素抗5mL全血），因为肝素过多会抑制淋巴细胞的转化，但也不宜太少，否则出现凝血现象。如果培养物中出现膜状凝块，可轻摇培养瓶使凝块散开。
2.在一般恒温箱内培养时，必须将瓶口塞紧，以免培养液的pH值发生较大的变化。培养基的pH值应调整在7.2～7.4之间，培养液酸化较严重（培养液呈黄色时）时，应加适量灭菌的1.4%NaHCO3溶液调整或加入2～3mL培养液等办法来校正。
3.秋水仙素的处理时间和使用浓度应随实验的要求而异，若想得到足够的中期分裂相，秋水仙素的处理时间宜长些，所用的浓度宜高些；若想得到较细长的染色体，处理时间短些，所用浓度宜低些，但注意，秋水仙素用量过多或作用时间过长，会导致染色体过分收缩或着丝粒分离，甚至染色体破碎。
4.制片中如发现染色体分散不佳，可重复固定或延长固定时间。同时要注意滴片时载玻片要冷却，无油污，细胞悬液浓度适宜，滴片高度及力度、技巧等。
5.制作G显带标本时的注意事项
（1）标本的片龄：标本保存时间越长，细胞对胰蛋白酶的抵抗性越大。片龄超过20d的标本往往导致染色体呈斑点状，而不是带纹。
（2）胰蛋白酶处理的温度：温度较高，反应速度较快，难以控制，关键控制较恒定的反应温度。如温度较低，要延长胰蛋白酶处理时间，故处理时间要与温度相匹配。
（3）胰蛋白酶液中的盐类成分：溶液中的二价阳离子会使反应减慢，但不能阻止这种反应。
六、试验试剂的配制
1.10μg/mL秋水仙素溶液
秋水仙素粉1mg溶于100mL灭菌生理盐水中，分装小瓶，4℃冰箱保存待用。
2.0.075mol/L KCl溶液
KCl 5.59g定溶于1000mL蒸馏水中即可，4℃冰箱保存待用。
3.Garnoy固定液
甲醇、冰醋酸按体积3∶1比例配制，现用现配。
4.2.5%胰蛋白酶溶液
胰蛋白酶1g生理盐水40mL制成2.5%的胰蛋白酶原液保存在冰箱的冷冻室。使用时取原液0.5mL加生理盐水60mL，配成0.02%胰蛋白酶的工作夜。
5.0.02%EDTA溶液
EDTA 0.2g、NaCl 8g、KCl 0.2g、Na2HPO41.152g、KH2PO4 0.2g、葡萄糖0.2g依次溶于三蒸水至1000mL，高压灭菌，4℃冰箱保存。
6.5%NaHCO3溶液
NaHCO35g溶于1000mL蒸馏水中。
7.吉姆萨染液
吉姆萨原液（pH6.8）：吉姆萨粉剂1.0g，置于研钵内，先加数毫升甘油，仔细研磨至呈无颗粒的糊状，加甘油到66mL，放入56℃温箱中2h，并不时研磨。待充分溶解后加66mL甲醇，混匀，并用滤纸过滤染液，用有色玻璃瓶避光保存。
10%吉姆萨工作液：临用时取吉姆萨原液1mL与pH6.8PBS缓冲液9mL混合即成。
8.PBS（pH6.8）
A液（1/15mol/L KH2PO4）：9.078g KH2PO4加蒸馏水到1000mL。
B液（1/15mol/L Na2HPO4）：11.876g Na2HPO4加蒸馏水1000mL。
用时取A液50.8mL、B液49.2mL混匀即为pH6.8的PBS。
（朱钟泊）