实验十　人类染色体及核仁形成区的观察

实验十　人类染色体及核仁形成区的观察

【实验目的】

（1）掌握人类染色体的形态、数目及性别差异。

（2）了解人类染色体银染核仁形成区的显微形态特征。

【实验准备】

1.材料 人外周血液淋巴细胞染色体标本。

2.仪器和器材 显微镜、水浴箱、培养皿、吸管、染红。拭镜纸。

3.试剂 5mol/L HCl、50%AgNO3（用时现配）、0.1%甲酸。

【实验原理】

人体外周血液淋巴细胞是成熟的免疫细胞，在正常情况下是处于G0期的。PHA（Phytohemagglutinin，植物血凝素）是人和其他动物有丝分裂的刺激剂，它能使处于G0期的淋巴细胞转化为淋巴母细胞，从而转入旺盛的有丝分裂，如果在细胞有丝分裂的高峰加入秋水仙素那么就可以破坏细胞中的纺锤体形成，使细胞停止于细胞分裂的中期，这样再通过一系列的制片过程，即可获得清晰且分散良好的人类染色体玻片标本。

正常人类的染色体共有46条，按其着丝点所存在的位置不同可分为三种，即：中央着丝粒染色体、亚中央着丝粒染色体和近端着丝粒染色体。在近端着丝粒染色体的短臂区，由于存在有转录的rRNA的基因，并且该基因在间期细胞核中是形成核仁的基本成分，因而称其为核仁形成区（Nucleolus organizer region，NOR）。在该区中，由于存在有可将Ag+还原为Ag的某种酸性蛋白质，因此可通过银染的方法，将该区镀上呈棕黑色的银，即为银染核仁形成区（AgNOR）。它的数量可在某种程度上反映出该细胞rRNA基因的活性。

近年来，通过生化和免疫化学的研究证明，能与Ag+特异性结合的某些酸性蛋白质为RNA聚合酶Ⅰ，其功能是催化rDNA转录成rRNA，进而形成核仁。

【实验内容】(https://www.daowen.com)

（一）人体外周血液淋巴细胞染色体玻片标本的观察

取已制备好的人染色体玻片标本，放于载物台上。通过低倍镜观察，可见大小不等的蓝紫色圆形结构，这即为淋巴细胞的间期核，其中呈棒状的结构就是染色体。注意由于此玻片标本几乎整片都有细胞分布，并且没有盖片，因此在观察时应分清正反面，以免将标本擦掉或无法在高倍镜下观察到分裂象。当在低倍镜下，按一定顺序寻找到较好的染色体中期分裂相时，再转高倍镜和油镜仔细观察并计数。在计数时，为了避免遗漏或重复，可将一个细胞内的全部染色体按自然分布划分成小区，分别计算各小区的染色体数，再相加即得出该细胞内的染色体总数。注意在观察和计数时，要区分好男女性别。

（二）人类染色体银染标本的制备及观察

（1）取少许已制备好的处于中期的人外周血液淋巴细胞悬液，滴1～2滴于刚从冰水中取出的冷载片上，吹散悬液，使细胞均匀分布于载片上，空气干燥制成染色体玻片标本。

（2）将制成的染色体玻片浸入装有5N HCl溶液的染缸中，常温处理5分钟。取出，用水反复冲洗，晾干后将标本面朝上放于培养皿中。

（3）0.1%甲酸和AgNO3，按1∶1配制成50%的AgNO3溶液，取该溶液0.5 ml滴加到标本上，盖上拭镜纸，放于56℃的水浴箱中处理3～5分钟，至镜纸呈棕色，取出载片，去掉拭镜纸，用水反复冲洗，室温晾干，镜检。

（4）在低倍镜下，可见标本背景呈浅黄色，染色体着色较深，其中NOR区呈现棕黑色。选择一染色体分散良好的中期分裂相，转换高倍镜和油镜继续观察，并精确计数10～20个细胞中，每个细胞各有多少条染色体的NOR区染成棕黑色，计算AgNOR的平均数。正常人的AgNOR值为4～8个/核型。一般说来，细胞中的AgNOR数量可在某种程度上反映出该细胞rRNA基因的活性。

【实验报告】

（1）绘制一个人的外周血液淋巴细胞中期分裂象图，并注明A、D、F、G组的组别或号数。

（2）计算出你所观察的人类染色体的AgNOR数：