实验九　细胞组分的化学反应

实验九　细胞组分的化学反应

【实验目的】

（1）掌握Brachet反应及碱性蛋白、酸性蛋白的细胞化学染色方法。

（2）了解核酸、蛋白质的细胞化学反应原理。

【实验用品】

1.材料和标本 蟾蜍、小白鼠。

2.器材和仪器 光学显微镜、解剖器材、载玻片、吸水纸、染色缸、盖玻片、水浴箱。

3.试剂 PBS缓冲液（pH7.2）、70%乙醇、5%三氯醋酸、0.1%碱性固绿、0.1%酸性固绿、无水乙醇、95%乙醇、冰醋酸、Giemsa染液、2.2%柠檬酸钠溶液、甲醇等。

【实验内容】

细胞化学方法，是研究细胞成分常用的方法之一。它是利用化学试剂与细胞内的某些物质进行化学反应，从而在细胞局部形成有色沉淀物，再通过显微镜对组织内的生物化学成分进行定性、定位、定量研究。

（一）核酸细胞化学

1.方法与步骤

（1）做涂片：脱臼法处死小鼠，取睾丸，剪碎，加几滴柠檬酸钠溶液制成细胞悬液，取细胞悬液作涂片，自然晾干。

（2）固定：甲醇固定液固定10分钟。

（3）染色：滴加Giemsa染液染25～30分钟。

（4）冲洗：自来水冲洗干净后蒸馏水稍洗。(https://www.daowen.com)

（5）观察。

2.观察结果 染色质或染色体呈蓝紫色，细胞质呈淡蓝色。

3.思考题 Giemsa染液主要用来显示细胞内何种成分？

（二）细胞内碱性蛋白和酸性蛋白的显示

1.原理 由于不同的蛋白质分子所带的碱性和酸性基团的数目不同，在pH不同的溶液中，蛋白质分子所带的净电荷多少不同。如在生理条件下，整个蛋白质所带负电荷多，则为酸性蛋白质；带正电荷多，则为碱性蛋白质。据此，可将标本经三氯醋酸处理提出核酸后，用不同pH的固绿染液分别染色，细胞内的酸性蛋白和碱性蛋白质显示出来。

2.方法

（1）以破坏脊髓法处死蟾蜍，将其腹面向上放入蜡盘中，剪开胸腔，打开心包。小心将心脏剪一小口，取心脏血一滴滴在干净载玻片一端，推片，按此法制备二张血涂片，室温晾干。

（2）将涂片作好标记放在70%乙醇中固定5分钟，室温晾干。

（3）放入60℃，5%三氯醋酸中30分钟，抽提出核酸。

（4）清水冲洗多次（3分钟以上），以冲去痕迹的三氯醋酸。

（5）滤纸吸干玻片上水分。

（6）一张片放入0.1%碱性固绿（pH8.0～8.5）中染色10～15分钟，另一张片放入0.1%酸性固绿（pH2.0～2.5）染色5～10分钟。

（7）清水冲洗，盖上盖片镜检。

3.结果 经碱性固绿染色片中，胞质、核仁不着色，细胞核大部分被染成绿色，是为碱性蛋白质存在处（参照照片）。经酸性固绿染色片中，因胞质和核仁中有酸性蛋白，被染成绿色。