摘 要
胶质母细胞瘤（glioblastoma multiforme，GBM）是成人中枢神经系统最常见最致命的原发性恶性肿瘤，常用治疗方法为手术治疗、放疗和化疗。但即使是联合应用手术治疗与放化疗，患者的预后仍然较差，确诊后的中位生存时间只有14个月。如何提高GBM治疗效果是神经外科临床和基础研究迫切需要解决的难题。目前的观点认为，GBM治疗效果的提高，依赖于对其发生发展过程中分子机制的进一步了解。
GBM的异常增殖是GBM的一个重要特征，抑制GBM细胞增殖可以提高患者的生存率，但目前还不清楚GBM细胞异常增殖的分子机制。本书前期通过基因芯片方法检测了大量基因在人脑GBM组织与正常脑组织中的表达量，发现G蛋白RND3基因表达水平在人脑GBM组织中远远低于其在正常脑组织中，体外细胞水平实验研究表明稳定高表达外源性RND3可以明显抑制GBM细胞的增殖。在此基础上进行的小鼠脑内种植GBM细胞的实验结果进一步显示高表达RND3可以明显抑制GBM肿瘤的生长。这些实验结果均提示：RND3通过抑制GBM细胞的增殖从而抑制肿瘤生长。
RND3作为小G蛋白GTP水解酶（small GTPase）家族中的一员，可以调节部分肿瘤细胞的增殖，但具体机制尚不清楚。前期实验结果提示RND3基因的表达水平与Notch1信号的强弱紧密相关，敲除小鼠颅内RND3基因可以激活Notch1信号通路。GBM细胞系U251细胞中RND3可以通过结合Notch1受体的活性形式—Notch1受体的膜内段—NICD，影响并降低细胞核内的NICD的表达水平。这些结果提示RND3可能通过调节细胞核内NICD的表达水平来调节Notch1信号，Notch1信号通路是调节GBM细胞增殖的关键信号通路，但到目前为止，Notch1信号调控细胞增殖的分子机制仍不清晰。如何准确、有效而又合理地控制Notch1信号仍然是GBM临床治疗中的巨大挑战。基于这些困难，本书在前期研究的基础上提出了RND3通过调节Notch1信号通路进而调节GBM细胞增殖的假说。为了验证这一假说，本书分为四部分进行研究：①RND3在GBM内的表达及与患者术后生存时间的关系；②RND3在GBM细胞增殖中的作用；③RND3调节GBM细胞增殖的机制；④RND3调节Notch1信号通路的分子机制。
2.1 RND3在GBM内的表达及与患者术后生存时间的关系
目的：
检测RND3在胶质母细胞瘤内的表达量，揭示RND3与患者术后生存时间的关系。
方法：
检测小鼠各个器官内特别是中枢神经系统中RND3的表达水平，为研究RND3在GBM细胞增殖中的作用提供生理依据；收集人脑GBM与正常脑组织，采用荧光双染检测RND3在胶质细胞、神经细胞及GBM细胞内的表达位置；采用免疫印迹技术与荧光定量PCR检测RND3蛋白在正常脑组织和GBM组织中的表达水平，应用student t test检验RND3蛋白水平在GBM与脑组织内的差别是否有统计学意义，应用mann-Whitney's test检验RND3 mRNA的表达水平在GBM与脑组织内的差别是否有统计学意义；采用免疫组织化学染色方法用于回顾性分析49例GBM患者RND3表达水平，定量后从小到大排列，前25例为RND3低表达组，后24例为RND3高表达组，患者术后存活时间为患者手术之后存活的月数，应用mann-Whitney's test和Kaplan-Meier test检验RND3低表达组和高表达组术后生存时间差异有无统计学意义，本文选取P＜0.05，差异有统计学意义。
结果：
（1）RND3在中枢系统高表达：Laz staing结果显示，RND3在中枢神经系统高表达；荧光定量PCR结果显示，RND3在脑组织内高表达。
（2）RND3在胶质细胞和神经元内高表达：免疫荧光双染结果显示，RND3在胶质细胞和神经元内高表达，且主要表达于细胞核内。
（3）RND3在GBM内主要表达于细胞核：免疫组织化学染色及免疫荧光结果显示，RND3在GBM细胞内主要表达于细胞核内。
（4）人脑GBM组织中的RND3表达水平低于正常脑组织：免疫组织化学染色结果显示，与正常脑组织相比，RND3在人脑GBM组织内低表达，RND3表达量从正常脑组织到GBM组织，逐渐降低。免疫印迹结果显示，在4例人脑GBM组织及配对脑组织中，RND3在GBM内蛋白表达量都低于其配对脑组织；荧光定量PCR结果显示，在4例人脑GBM组织及配对脑组织中，RND3在GBM内mRNA表达量都低于其配对脑组织（P＜0.05）。免疫印迹结果显示，RND3在15例GBM内蛋白平均表达量低于在15例正常脑组织的蛋白平均表达量（P＜0.001）；荧光定量PCR结果显示，RND3在13例GBM内mRNA平均表达量低于在13例正常脑组织mRNA的平均表达量（P＝0.001＜0.05）。
（5）RND3低表达患者的生存时间短于RND3高表达的患者：RND3低表达组患者生存时间明显短于RND3高表达组患者，差异具有统计学意义（P＜0.001）。
结论：RND3在GBM组织内低表达，可能在GBM发生发展中有重要作用。
关键词：RND3 GBM 生存时间
2.2 RND3在GBM细胞增殖中的作用
目的：
本研究发现RND3在GBM内低表达并与患者的预后密切相关，提示RND3可能是GBM发生发展中的一个关键作用因子，因而需要进一步探讨RND3在GBM细胞中的作用。
方法：
构建RND3基因敲除小鼠，观察其是否能自发形成GBM，并观察小鼠中枢神经系统相关变化；采用免疫组织化学染色方法回顾性分析20例人脑GBM患者肿瘤中RND3表达量，定量后按照从小到大排列，较小的10例定义为RND3低表达组，较大的10例定义为RND3高表达组，采用mann-Whitney's test分析两组肿瘤大小（肿瘤大小为手术时切除的肿瘤大小）之间的差异有无统计学意义；免疫印迹技术定量检测后，使用Pearsont t test分析15例GBM组织和相应正常脑组织中的RND3表达量与Histone H3磷酸化水平之间的相关性；检测U87及U251细胞内RND3表达量，选出本研究所需的主要细胞；构建稳定高表达和低表达RND3的四个GBM细胞系：GFP、GFP-RND3、siCtrl和siRND3，应用细胞计数法绘制1～4天细胞生长曲线，应用student t test检验高表达、低表达RND3组与其各自对照组之间的差异有无统计学意义；BrdU法检测细胞增殖，并进行定量分析，计算各组阳性细胞百分比，应用student t test检验高表达、低表达RND3组与其各自对照组之间的差异有无统计学意义；免疫印迹技术检测细胞内Histone H3磷酸化水平；通过立体定向法将RND3高表达和正常表达的GBM细胞分别注射到裸鼠右脑尾状核，15周后取鼠脑观察肿瘤大小并进行定量分析。
结果：
（1）成功构建RND3基因敲除小鼠：RND3基因敲除小鼠构建成功，无自发性GBM形成。较对照组小鼠而言，RND3基因敲除小鼠生长发育缓慢，但脑部发育先于对照组小鼠。
（2）人脑GBM组织中RND3表达水平与肿瘤大小和HistoneH3磷酸化水平均呈负相关：RND3高表达组患者肿瘤组织的体积小于RND3低表达组患者（P＝0.015＜0.05）；肿瘤组织中RND3表达水平与Histone H3磷酸化水平呈负相关（R＝-0.4598，P＝0.0053＜0.05）。
（3）选择U251细胞作为研究GBM的主要细胞：U251和U87都有RND3表达，但RND3在U251中表达相对较低，而Histone H3的磷酸化水平相对较高。因为本书重点研究高表达RND3对GBM的作用，U251细胞中RND3表达降低，转染RND3质粒后，更易得到与野生型U251细胞对比明显的RND3表达量，从而引起细胞表型和相关信号通路的改变；且U251中的RND3也可以检测到，足以用于RND3敲除实验，因此，选用U251作为本实验的主要细胞，同时使用U87细胞进行验证。
（4）成功构建RND3高表达和RND3低表达的稳定细胞系：在波长488nm的激发光线刺激下细胞发出均一的绿色荧光，免疫印迹结果显示，高表达RND3的细胞RND3蛋白表达量明显升高，低表达RND3的细胞RND3蛋白表达量明显降低；荧光定量PCR结果显示，高表达RND3的细胞，RND3的mRNA明显升高（P＜0.0001）；低表达RND3的细胞，RND3的mRNA明显降低（P＜0.0001）。
（5）RND3可以在体外负性调节GBM细胞增殖：细胞增殖曲线显示，在第一天和第二天，高表达RND3（GFP-RND3组）细胞数量明显减少（P＜0.05），低表达RND3（siRND3组）细胞数量明显增多（P＜0.05）；在第三天和第四天，差异进一步扩大，高表达RND3组（GFP-RND3组）细胞数量明显减少（P＜0.05），低表达RND3（siRND3组）细胞数量明显增多（P＜0.05）。BrdU结果显示，高表达RND3细胞BrdU阳性细胞比例变小（P＝0.003＜0.05），低表达RND3细胞BrdU阳性细胞比例变大（P＝0.003＜0.05）。免疫印迹结果显示，高表达RND3，Histone H3磷酸化表达水平降低；低表达RND3，HistoneH3磷酸化水平升高。
（6）RND3在体内可以抑制GBM肿瘤生长：9只GFP组裸鼠都有肉眼可见肿瘤，而9只GFP-RND3组裸鼠只有一只具有很小的肉眼可见肿瘤，定量后发现，高表达RND3组（GFP-RND3）肿瘤的体积明显小于对照组（GFP）（P＜0.001）。
结论：
（RND3可以抑制GBM细胞增殖和GBM肿瘤生长。）
关键词 RND3 GBM 细胞增殖
2.3 RND3调节GBM细胞增殖的机制(https://www.daowen.com)
目的：
RND3可以调节GBM细胞的增殖，但机制尚不清楚。应用基因芯片技术检测RND3基因敲除小鼠脑组织内基因表达后发现多个Notch1信号通路靶基因表达升高，提示RND3可能调节Notch1信号通路。拟研究RND3对Notch1信号通路的作用及Notch1信号通路在RND3调节GBM细胞增殖中的作用。
方法：
采用基因芯片技术检测RND3基因敲除小鼠脑组织中基因表达的变化，并采用荧光定量PCR和免疫印迹技术检测RND3基因敲除小鼠和正常小鼠脑组织中Notch1信号通路靶基因HES1的蛋白和mRNA表达量，应用student t test检验差异有无统计学意义；应用荧光定量PCR检测在上调或下调RND3表达后的GBM细胞中Notch1信号通路靶基因表达的变化，荧光素酶法检测Notch1信号通路活性变化，免疫印迹技术检测Notch1信号调节的蛋白表达变化，应用student t test检验差异有无统计学意义；采用免疫组织化学染色、免疫印迹技术和荧光定量PCR等方法检测人脑GBM组织与正常脑组织中Notch1及Notch1信号通路靶基因HES5的表达水平，采用Pearson t test检验RND3与HES5表达水平的相关性。应用细胞计数法和BrdU法检测活化Notch1信号通路（转染Flag-NICD）或抑制Notch1信号通路（Compound E和siNotch1）后各组细胞数量和BrdU阳性细胞数量，并绘制生长曲线和计算BrdU阳性细胞百分比，应用student t test检验差异有无统计学意义。转染Flag-NICD到稳定高表达RND3的细胞中，BrdU法和细胞计数法检测GFP、GFP-RND3和GFP-RND3＋Flag-NICD组的细胞数和BrdU阳性细胞数，计算BrdU阳性细胞百分比，应用one way anova检验三组之间差异有无统计学意义。将GBM细胞分为两组，给予DMSO和Compound E处理，分别转染siCtrl和siRND3后分为两个亚组；在第1、2、3、4天，使用细胞计数分别得到各个亚组细胞数，应用one way anova检验各组之间差异有无统计学意义；将GBM细胞分为两组，给予siCtrl和siNotch1处理，分别转染siCtrl和siRND3后分为两个亚组；在第1、2、3、4天，使用细胞计数分别得到各个亚组细胞数，应用one way anova检验各组之间差异有无统计学意义。
结果：
（1）RND3在中枢神经系统中可以调节Notch1信号通路：基因芯片结果显示，RND3基因敲除小鼠脑组织中Notch1信号通路中的多个靶基因表达增加；免疫印迹及荧光定量PCR结果显示RND3基因敲除小鼠的脑组织内的HES1蛋白和mRNA表达水平均明显增高（P＜0.05）。
（2）RND3在GBM内可以负性调节Notch1信号通路：在U251细胞中，荧光定量PCR结果显示，高表达RND3U251细胞中HES1的mRNA表达降低（P＝0.0077＜0.05），低表达RND3 U251细胞中HES1的mRNA表达增加（P＝0.0016＜0.05）；免疫印迹技术结果显示，高表达RND3细胞中HES1蛋白表达降低，低表达RND3细胞中HES1的蛋白表达增高；荧光素酶结果显示，细胞中RND3高表达时荧光素酶活性降低（P＝0.0001＜0.05），反之荧光素酶活性升高（P＝0.0002＜0.05）；在U87细胞和293T细胞中得到的结果与U251细胞一致；在正常人脑组织和GBM组织中，RND3mRNA表达量与HES5mRNA表达量呈负相关（R＝-0.8430，P＝0.0002＜0.05）。
（3）Notch1信号通路可以调节GBM细胞增殖：免疫组织化学染色及免疫印迹结果显示，GBM组织内Notch1及Notch1靶基因HES5的表达高于正常脑组织。Flag-NICD激活Notch1信号通路后，细胞中HistoneH3磷酸化水平升高，细胞数明显增多（P＜0.05），BrdU阳性细胞百分比增大（P＜0.05）；Compound E或siNotch1抑制Notch1信号通路后，细胞内HistoneH3磷酸化水平明显降低，细胞数明显减少（P＜0.05），BrdU阳性细胞百分比明显减小（P＜0.05）。
（4）RND3通过调节Notch1信号通路调节GBM细胞增殖：在体外培养环境下，高表达RND3（GFP-RND3组）U251细胞比正常表达RND3（GFP组）U251细胞的细胞数明显减少，BrdU阳性细胞百分比减小；然而，与GFP组相比，高表达RND3和NICD（GFPRND3＋Flag-NICD组）U251细胞的细胞数与BrdU阳性细胞数没有明显改变，差异无统计学意义（P＝0.292＞0.05）。在U251细胞中，敲低RND3，细胞数增多（P＜0.05），然而，在阻断Notch1信号通路的U251细胞中，敲低RND3，细胞数量无明显改变，与对照组相比，差异无统计学意义（P＞0.05）。
结论：
（GBM中RND3可以负性调节Notch1信号通路，Notch1信号通路是RND3调节GBM细胞增殖的关键信号通路。）
关键词：RND3 Notch1信号通路 细胞增殖
2.4 RND3调节Notch1信号通路的机制
目的：
RND3在GBM内通过调控Notch1信号通路调节细胞增殖，但具体机制尚不明确。在Notch1信号通路中，Notch1经剪切生成NICD，进入细胞核，在MAML 1的参与下与CSL结合形成NICDCSL-MAML 1集团，绑定到Notch1信号通路靶基因启动子上，进而调节靶基因的表达；前述研究发现，RND3主要表达于细胞核中，因此其可能在细胞核内发挥主要作用，而在Notch1信号通路中，处于细胞核且发挥关键作用的是NICD-CSL-MAML 1集团，因此，本文主要研究RND3是否通过调节NICD-CSL-MAML 1集团进而调节Notch1信号通路。
方法：
采用免疫荧光检测RND3、Notch1、CSL和MAML 1在GBM细胞U251内的表达；采用免疫印迹技术检测高表达RND3后Notch1、CSL和MAML 1的表达量及细胞核内NICD的表达量；采用荧光定量PCR检测高表达RND3后Notch1、CSL和MAML 1的mRNA表达量；采用免疫共沉淀检测RND3是否与Notch1、CSL和MAML 1结合；采用Chip检测高表达RND3后NICD与HES1启动子的结合数量，应用one way anova检验各组之间差异有无统计学意义；转染Flag-NICD到稳定高表达RND3的U251细胞，采用荧光定量PCR检测GFP、GFP-RND3和GFP-RND3＋Flag-NICD组 细 胞 中HES1的mRNA表达量，应用one way anova检验三组之间差异有无统计学意义；将GBM细胞分为两组，给予siCtrl和siNotch1处理，分别转染siCtrl和siRND3后分为两个亚组，应用荧光定量PCR检测各个组HES1的mRNA表达量，应用one way anova检验各个组之间差异有无统计学意义；采用免疫印迹技术检测RND3和Notch1在15例正常人脑组织和15例GBM组织中的表达量，定量并采用Pearson t test检验RND3与Notch1蛋白表达量的相关性；采用免疫印迹技术检测高表达RND3在阻断泛素化途径的情况下对NICD的作用。
结果：
（1）RND3与Notch1都主要表达于细胞核：免疫荧光双染结果显示，GBM细胞系U251细胞、GBM组织中的RND3和Notch1主要表达于细胞核内，而且具有相同的表达位点。
（2）RND3与NICD结合：免疫共沉淀结果显示，在Myc-RND3沉淀的蛋白中，可以检测到Flag-NICD；在Flag-NICD沉淀的蛋白中，可以检测到Myc-RND3。
（3）RND3可以降低NICD蛋白表达量，但mRNA表达量无明显改变：免疫印迹结果显示，高表达RND3可以降低NICD的表达量，尤其是细胞核内NICD的表达量；荧光定量PCR结果显示，高表达RND3（GFP-RND3组）时，Notch1的mRNA表达量无明显改变（P＞0.05）。
（4）RND3与CSL表达位置相同：免疫荧光双染结果显示，RND3与CSL在GBM中主要表达于细胞核，且表达位点相同。
（5）RND3可以与CSL结合：免疫共沉淀结果显示，在GFPRND3沉淀的蛋白中，可以检测到Myc-CSL；在Myc-CSL沉淀的蛋白中，可以检测到GFP-RND3。
（6）高表达RND3可以降低CSL蛋白表达量，但CSL mRNA无明显改变：免疫印迹结果显示，高表达RND3，CSL蛋白表达量明显降低；荧光定量PCR结果显示，高表达RND3时，CSL的mRNA表达量无明显改变（P＞0.05）。
（7）RND3与MAML 1表达位置相同：免疫荧光双染结果显示，RND3与MAML 1在GBM中主要表达于细胞核，且表达位点相同。
（8）RND3可以与MAML 1结合：免疫共沉淀结果显示，在GFP-RND3沉淀蛋白中，可以检测到Flag-MAML 1；在Flag-MAML 1沉淀的蛋白中，可以检测到GFP-RND3。
（9）高表达RND3可以降低MAML 1蛋白表达量，但MAML 1的mRNA表达量无明显改变：免疫印迹结果显示，高表达RND3，MAML 1蛋白表达量明显降低；荧光定量PCR结果显示，高表达RND3时，MAML 1的mRNA表达量无明显改变（P＞0.05）。
（10）RND3调节NICD表达量是RND3调节Notch1信号通路的关键：CHIP结果显示，高表达RND3后，NICD与HES1启动子结合减少（P＜0.001）。在U251细胞中，高表达RND3（GFP-RND3组），HES1的mRNA表达明显降低（P＜0.001），同时高表达RND3与Flag-NICD（GFP-RND3＋Flag-NICD组），HES1的mRNA表达量与对照组（GFP组）相比，差异无统计学意义（P＝0.3121＞0.05）。在U251细胞中，敲低RND3（siRND3），HES1的mRNA表达量明显升高（P＝0.02529＜0.05），然而，在阻断NICD表达（siNotch1）的U251细胞中，敲低RND3（siRND3），HES1的mRNA表达量无明显改变，与对照组相比，差异无统计学意义（P＝0.2118＞0.05）。在GBM组织和正常脑组织中，RND3与Notch1蛋白表达量负相关（R＝-0.6003），具有统计学意义（P＝0.0002＜0.05）。
（11）RND3通过调节NICD稳定性调节NICD表达量：免疫印迹结果显示，NICD表达量随RND3表达量增加而减少，但当我们使用MG-132阻断细胞的泛素化时，NICD表达量随着RND3表达量增加无明显改变。
结论：
RND3通过降低NICD-CSL-MAML 1集团的表达量抑制Notch1信号通路，这一过程的关键是RND3对NICD表达量的调节。
关键词：RND3 NICD CSL MAML 1 HES1