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武汉大学优秀博士学位论文文库编委会
武汉大学优秀博士学位论文文库
总 序
摘 要
2.1 RND3在GBM内的表达及与患者术后生存时间的关系
2.2 RND3在GBM细胞增殖中的作用
2.3 RND3调节GBM细胞增殖的机制
2.4 RND3调节Notch1信号通路的机制
Abstract
2.1 RND3 expression level in human glioblastoma and the relationship with the survival time of glioblastoma patients
2.2 RND3 regulated glioblastoma cells proliferation and tumor growth
2.3 RND3 regulated GBM proliferation by negatively regulating Notch1 signaling
2.4 RND3 regulated Notch1 signaling by decreasing NICD expression in glioblastoma
引 言
第1章 材料与方法
1.1 免疫组织化学染色
1.1.1 制作蜡块
1.1.2 切片
1.1.3 免疫组织化学染色
1.2 免疫荧光双染
1.2.1 石蜡切片脱蜡至水
1.2.2 抗原修复
1.2.3 消除内源性过氧化物酶活性
1.2.4 孵育一抗
1.2.5 滴加荧光二抗
1.2.6 封片
1.3 免疫印迹技术
1.3.1 样品的制备
1.3.2 BSA测蛋白浓度
1.3.3 蛋白变性
1.3.4 电泳
1.3.5 转膜
1.3.6 封闭
1.3.7 孵育一抗
1.3.8 孵育二抗
1.3.9 显影
1.4 荧光定量PCR技术
1.4.1 提取RNA
1.4.2 逆转录
1.4.3 PCR
1.5 生存时间及肿瘤大小
1.6 细胞培养
1.6.1 细胞复苏培养
1.6.2 细胞传代
1.6.3 细胞冻存
1.6.4 细胞蛋白提取与定量
1.6.5 细胞RNA提取
1.7 细胞转染
1.7.1 293T细胞转染
1.7.2 U251及U87细胞转染
1.8 质粒体的扩增与提取
1.8.1 感受态细胞的制备
1.8.2 质粒体的转化
1.8.3 质粒的扩增与提取
1.8.4 酶切鉴定
1.8.5 中提
1.9 稳定细胞系的建立
1.9.1 病毒制备
1.9.2 感染细胞
1.9.3 细胞筛选
1.10 BrdU
1.10.1 细胞处理
1.10.2 细胞的免疫荧光
1.11 立体定向种植脑肿瘤
1.11.1 肿瘤细胞的制备
1.11.2 裸鼠麻醉
1.11.3 定位及钻孔
1.11.4 种植肿瘤细胞
1.11.5 取脑
1.12 RND3基因敲除小鼠的构建与饲养
1.13 基因芯片技术
1.14 双荧光素酶报告分析系统
1.14.1 质粒
1.14.2 质粒介绍
1.14.3 质粒体转染(https://www.daowen.com)
1.14.4 实验步骤
1.15 逆转实验
1.15.1 Compound E浓度摸索
1.15.2 siRND3和siNotch1浓度及时间摸索
1.15.3 使用Compound E逆转实验
1.15.4 使用siNotch1逆转实验
1.16 免疫沉淀
1.16.1 细胞转染
1.16.2 蛋白提取
1.16.3 沉淀蛋白
1.16.4 去除非特异性蛋白
1.16.5 免疫印迹
1.17 定量ChIPs
1.17.1 细胞的固定和收集
1.17.2 细胞裂解
1.17.3 免疫沉淀
1.17.4 DNA纯化
1.18 MG132实验
1.18.1 细胞准备
1.18.2 MG132处理
1.19 laz staing
1.20 统计学方法
第2章 实 验 结 果
2.1 RND3在GBM中的表达量及其与患者预后的关系
2.1.1 RND3在中枢系统高表达
2.1.2 RND3在胶质细胞和神经元内高表达
2.1.3 RND3在GBM内主要位于细胞核
2.1.4 与人脑组织相比，RND3在人脑GBM的表达量降低
2.1.5 RND3与患者生存时间密切相关
2.2 RND3在GBM细胞增殖中的作用
2.2.1 RND3可以调节中枢神经系统细胞增殖
2.2.2 RND3在人脑GBM中的表达量与肿瘤大小呈负相关，与HistoneH3磷酸化水平呈负相关
2.2.3 体外实验细胞的选择
2.2.4 稳定细胞系的构建
2.2.5 RND3可以在体外调节GBM细胞增殖
2.2.6 RND3在体内可以调节GBM肿瘤生长
2.3 RND3调节GBM细胞增殖的机制
2.3.1 RND3在中枢神经系统中可以调节Notch1信号通路
2.3.2 RND3在GBM内可以调节Notch1信号通路
2.3.3 调解Notch1信号通路可以调节GBM细胞增殖
2.3.4 RND3通过Notch1信号通路调解细胞增殖
2.4 RND3调节Notch1信号通路的分子机制
2.4.1 RND3与NICD都主要表达于细胞核内
2.4.2 RND3可以降低NICD表达量
2.4.3 RND3与NICD结合
2.4.4 RND3与CSL表达位置相同
2.4.5 RND3可以与CSL结合
2.4.6 RND3通过转录后途径调节CSL表达量
2.4.7 RND3与MAML 1表达位置相同
2.4.8 RND3与MAML 1相互结合
2.4.9 RND3通过转录途径调节MAML 1表达量
2.4.10 RND3调节NICD表达量是RND3调节Notch1信号通路的关键
2.4.11 RND3通过调节NICD稳定性调节NICD表达量
2.4.12 RND3调节Notch1信号通路的模式图
第3章 讨 论
3.1 RND3在GBM组织中异常性低表达并在GBM发生发展中有重要作用
3.2 RND3可以抑制GBM细胞的增殖
3.3 RND3调控GBM细胞增殖的机制是调控Notch1信号通路
3.3.1 RND3可以调节Notch1信号通路
3.3.2 RND3通过调节Notch1信号通路调解GBM细胞的增殖
3.3.3 Notch1信号通路可以调节GBM细胞增殖
3.3.4 RND3调节GBM细胞增殖的关键信号通路是RND3调节的Notch1信号通路
3.3.5 RND3降解NICD表达量是通过泛素化途径
第4章 综述：RND蛋白的作用和调节
4.1 结构和表达
4.2 RND蛋白在肌动蛋白细胞骨架中的作用
4.3 RND蛋白的靶点
4.4 RND蛋白靶蛋白的演变
4.5 RND蛋白的调控
4.6 RND3磷酸化
4.7 泛素/蛋白酶体途径降解
4.8 RND3蛋白在肿瘤中的表达与作用
4.9 结论和展望
参考文献