定量PCR仪的类型
定量PCR仪是在普通PCR仪的基础上增加一个荧光信号采集系统和计算机分析处理系统,主要由PCR系统和荧光检测系统两部分组成。多色多通道的荧光检测系统是目前定量PCR仪发展的主流趋势,仪器的激发通道越多,仪器适用的荧光素种类越多,仪器适用范围就越宽。多通道指可同时检测一个样品中的多种荧光,仪器可以同时检测单管内多模板或者内标+样品。通道越多,仪器适用范围越宽,性能就更强大。
定量PCR仪不断推陈出新,不同类型的定量PCR仪,各有特点,但主要可以分成以下三种。
1.传统的96孔板式定量PCR仪
96孔板式定量PCR仪可采用传统的96孔板甚至384孔板进行批量的定量反应,有些型号还兼容8连管和单管。传统96孔板式定量PCR仪的优点是可容纳的样本量大而且无须特殊耗材,但是缺点也显而易见:传统96孔板反应板面积大,温度控制的精确性低、升降温速度也相对较慢,因而反应速度也较慢;板固定加热模块的PCR温度控制有边缘效应;样品槽上每个孔之间的温度存在差异,即存在位置效应,因此标准曲线的反应条件难以做到与样本完全一致,样本和样本之间的温度控制也可能存在差异,对于灵敏度极高的定量PCR来说,任何极微小的差异都会以指数级别的规模被放大,不得不说这是一种缺憾。在96孔板定量PCR仪的荧光检测分析系统中,由于96孔板上样品孔的位置是固定的,每个样品孔距离光源和监测器的光程各不相同,这就有可能对结果产生影响。此外检测是在孔板或管底进行,其透光性和厚薄均一性都可能对实验结果产生影响。传统的96孔板式定量PCR仪以ABI公司生产的为代表,MJ和Bio-Red公司的定量PCR仪也属于这一类,但Bio-rad的IQ系列荧光定量PCR带有梯度功能。
2.创新概念的离心式实时定量PCR仪
离心式实时定量PCR仪的扩增样品槽被巧妙地设计为离心转子的模样,借助空气加热和转子在腔内旋转,避免了边缘效应,很好地解决了每个样品孔之间的温度均一性的关键问题,使样品间温度差异小于±0.01℃,最大限度地保障了标准曲线和样品之间条件的一致性。借助旋转离心力还可以随时将可能凝在管壁和盖子上的液滴离心到管底而无须热盖;还可以将酶加在管盖上,升温后离心到管底与反应体系混合,实现“机械的热启动功能”。由于转子上的样品孔是旋转可移动的,因而离心式荧光检测系统可以固定激发光源和荧光检测器,随时检测旋转到跟前的样品管;由于每个样品管在检测时距离检测器和激发光源的距离都是一样的,使用的又是同一个检测器和激发光源,因此有效减少了不必要的系统误差。
创新的离心式仪器通常选用LED激发、PMT检测,离心式的设计避免了边缘效应。LED光源是冷光源,对实验没有影响,因此运行前无须预热,无须采用其他荧光染料校正仪器,系统检测重复性也更好,而且使用寿命长,无须经常更换。PMT每次只能收集单个荧光信号,但是检测灵敏度高。Corbett的Rotor-gene系列和Roche的Lightcycler系列均为这一类仪器。
离心式定量PCR仪的缺点主要是离心的转子小,能容纳的样本量有限,由于是离心式转子,常规的96孔板和条形管就不适用,有的还需要特殊的消耗品,增加使用成本,此外,离心式定量PCR仪不可能带梯度功能,存在时间积分等缺点。
3.Smart CyclerⅡ荧光定量PCR仪
第三类定量PCR仪是以Cepheid公司的Smart CyclerⅡ为代表,它机型小巧,只有16个样品槽。其独到之处在于这16个样品槽分别拥有独立的智能升降温模块,也就是说这16个样品槽相当于16台独立的定量PCR仪。独立控温的好处首先是可在同一定量PCR仪上分别进行不同条件的定量PCR反应。
此外,每个温控模块只控制一个样品槽,升降温速度当然更快,可高达10℃/s,每个模块独立控制的激发光源和检测器直接与反应管壁接触,保证荧光激发和检测不受外界干扰,固定的结构使得仪器运行更稳定,使用寿命更长。整合有4通道光学检测系统,分别可以检测FAM/SYBR GreenⅠ,TET/Cy3,Texas Red和Cy5,可在同一样本中进行多靶点分析,同时检测4种荧光信号,可使用多种检测方法,包括Taq Man探针、分子信标、Amplifluor引物和Scorpion引物和荧光内插染料等。
Smart CyclerⅡ扩增速度快,只要20 min就可以完成常规的定量PCR反应,大大提高了工作效率,满足高速批量的要求,也能兼顾灵活的需要,特别适合多成员、多用途的使用。但Smart CyclerⅡ也存在着需要使用独家的扁平反应管、增加了反应成本、上样不如传统方法方便等缺点。
不同的定量PCR仪每种设计都有它的独到之处,但也都有无法避免的缺憾,在价格上和耗材上也有很大的差异,所以在选购定量PCR仪前要根据自己的需要出发,选择更适合自己需要的仪器。