组蛋白甲基化与去乙酰化对蛇足石杉内生真菌盘长孢状刺盘孢合成石杉碱甲的影响
沈鹏原1，2 康信聪1，2 胡莉琴1，2 张家银1，2 刘东波1，2，3，4
(1.湖南农业大学园艺园林学院 湖南 长沙 410128；2.国家中医药管理局亚健康干预技术实验室 湖南 长沙 410128；3.湖南省作物种质创新与资源利用重点实验室 湖南 长沙 410128；4.湖南省植物功能成分利用协同创新中心 湖南 长沙 410128)
摘要：以蛇足石杉Huperzia serrata内生真菌盘长孢状刺盘孢Cg01菌株为研究对象，利用PEG介导的同源重组转化体系，对Cg01组蛋白甲基化酶基因(histone methyltransferases，HMT)CgClr4和组蛋白去乙酰化酶基因(histone deacetylase，HDAC)CgClr3、CgSir2进行基因敲除与回补，并通过实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测了回补株中对应基因表达量以及高效液相色谱HPLC检测突变体菌株中石杉碱甲huperzine A(Hup A)产量。结果显示3个基因敲除突变体菌株ΔCgClr4、ΔCgClr3、CgSir2的Hup A产量分别为255μg/L、270μg/L、244μg/L，与野生型菌株相比分别下降了21.3%、16.6%、24.7%。在 基 因 回 补 突 变 体 菌 株ΔCgClr4/CgClr4、ΔCgClr3/CgClr3、ΔCgSir2/CgSir2中，相应回补基因表达均与野生型无显著性差异，其Hup A产量分别为351.9μg/L、334.7μg/L、331μg/L，回补菌株的Hup A产量回复到野生型水平。结果表明这3个基因均具有调控内生真菌盘长孢状刺盘孢Cg01合成Hup A的作用，为研究蛇足石杉内生真菌中石杉碱甲的合成调控机制提供了理论基础和新的思路。
关键词：组蛋白，基因敲除，基因回补，石杉碱甲，生物合成(https://www.daowen.com)
石杉碱甲(huperzine A，Hup A)是1986年我国研究者首次从蛇足石杉Huperzia serrata中分离得到的高效乙酰胆碱酯酶抑制剂，毒副作用低(Wang et al.1986)，对早期老年痴呆具有显著疗效，已开发为治疗阿尔兹海默症(AD)的临床药物(郑瑞等2018)。目前Hup A类药物的生产，主要以野生蛇足石杉为原材料，但在自然条件下蛇足石杉植株矮小，生长十分缓慢，且含量过低(袁经权等2012)。同时，Hup A的化学合成步骤繁琐、价格昂贵，不具产业化意义。这些因素限制了Hup A产业的发展。自1993年stierle et al.(1993)从药用植物太平洋短叶红豆杉韧皮部中分离到1株能产紫杉醇的内生真菌Taxomyces andreanae以来，人们逐渐认识到药用植物中内生真菌能够产生与宿主植物相同或相似的药用活性成分，为解决珍稀濒危药用植物资源保护和可持续利用的关键问题提供了新思路。迄今已有大量文献报道从石杉科植物中分离出可产Hup A的内生真菌。汪涯等在蛇足石杉分离出能产Hup A的内生真菌黄曲霉Aspergillus flavus LF40(汪涯等2011)；鞠錾从柳杉叶马尾杉中分离出能产生石杉碱甲的内生真菌芽孢菌属HA15和葡萄孢属HA23(鞠錾等2009)。
然而，在利用内生真菌进行发酵时发现，得到的次生代谢产物产量有限，且分离纯化及频繁传代易导致菌种退化、代谢产物的活性和含量不稳定等问题(Hedden et al.2001)。自2006年Keasling小组在酿酒酵母中组装了一条高效合成青蒿酸的代谢途径使最终的青蒿酸产量提高了500倍后，采用合成生物学设计和改造微生物菌株来大量生产代谢产物已被认为是一种极具潜力的资源获取方法(Ro et al.2006)。在内生真菌中，代谢产物的表达受到诱导物、转录调控因子、碳源代谢阻遏作用等多重因素的影响。表观遗传修饰作为基因表达调控的重要方式，在代谢产物表达过程中发挥着重要作用。目前，关于表观遗传修饰在真菌代谢表达调控方面的研究仍相对较少，尚有许多不足。例如利用小分子化学物质对真菌进行表观遗传修饰，激活沉默的生物合成相关基因，提高真菌次生代谢产物产量或诱导真菌产生未知的次生代谢产物(Christoph et al.2013)，但很多真菌对小分子化学物质会产生抗性，通过这种方式实现的表观遗传修饰方式在传代中很不稳定。相比之下，通过分子遗传学操作来进行表观遗传修饰，遗传稳定性大大提高(Gross 2007)。开展内生真菌中石杉碱甲的合成与调控机制研究，对利用合成生物学技术改造和优化天然表达体系，或者在异源宿主中重建生物合成途径，构建石杉碱甲高产菌株，实现资源的可持续发展具有重要意义。
本课题组前期从福建南平H.serrate中分离出具有合成Hup A的内生真菌盘长孢状刺盘孢Colletotrichum gloeosporioides Cg01，进行了全基因组测序及转录组测序，并完成了基因的筛选及功能注释。本研究在此基础上，筛选获得1个组蛋白甲基化酶基因CgClr4和2个组蛋白去乙酰化酶基因CgClr3，CgSir2。对候选基因进行基因敲除、基因回补等体内试验，并通过测定生物量及采用高效液相色谱(High performance liquid chromatography，HPLC)检测Hup A产量变化，完成对候选基因的功能分析，以期获得调控内生真菌合成石杉碱甲的关键基因，为内生真菌合成与调控石杉碱甲机制研究提供新的思路和理论基础。