1.2　试验方法

1.2　试验方法

1.2.1 制备斜面菌种

按无菌操作对4号菌株进行转管接种，在22℃下恒温培养，直到菌丝长满斜面培养基(斜面培养基为PDA培养基)。

1.2.2 液态摇瓶发酵

液态发酵培养基如下：蔗糖2.4%、葡萄糖1.2%、蛋白胨0.4%、酵母浸出粉0.2%、KH2 PO4 0.15%、MgSO4·7H2 O 0.1%。p H为6.5～6.8，温度22℃，转速130r/min，摇床黑暗中培养。

每个500mL三角瓶分装100mL液体培养液，灭菌冷却后将4号菌株的斜面菌种分别接入三角瓶内，按上述条件置恒温振荡器上培养。培养期间，从培养的第3天至第21天每天取三角瓶3个，抽滤分离菌丝体和发酵液后分别进行取样检测。

1.2.3 发酵罐深层发酵试验

在摇瓶实验的基础上，进行10L发酵罐深层培养。发酵罐发酵条件为：罐压0.05MPa、搅拌速度130r/min、空气流量210L/h、培养温度22℃、添加质量分数为0.03%的食用消泡剂(主要成分为单甘脂、磷脂、轻质碳酸钙等)。培养基配方如1.2.2所述条件，接种菌龄为5d，接种量10%，发酵时间12d。

1.2.4 生物量测定

将培养好的发酵液，经过抽滤得到菌丝体滤饼，50℃真空干燥至恒重，用电子天平称量。(https://www.daowen.com)

1.2.5 胞外多糖分析

测量上述收集的滤液体积，加3倍体积的95%乙醇沉淀多糖，置于4℃冰箱中过夜，沉淀多糖用蒸馏水复溶后，采用苯酚　硫酸法测定多糖浓度［9］。

1.2.6 菌丝体胞内多糖分析

称取一定量干燥菌丝体，粉碎，加20倍体积蒸馏水，100℃水浴浸提3h，高速离心(4000r/min)10min，收集上清液，加入3倍体积95%乙醇沉淀，置于4℃冰箱过夜，过滤，多糖用蒸馏水复溶，苯酚　硫酸法测定多糖浓度。

1.2.7 虫草酸含量测定

精密称取0.5g菌丝体干粉，置于50mL三角瓶中，加25mL蒸馏水，置80℃水浴中，浸提1.0h，离心，上清液转入25mL容量瓶中，残渣用水洗涤2次，定容。取发酵液及菌丝体提取液稀释至所需浓度，按文献［10］测定虫草酸含量。

1.2.8 虫草素检测

菌丝体加液氮研磨成粉末，称取粉末0.1g加入2mL纯净水，超声波100W、60℃处理50min，4000r/min离心10min，取上清液，重复提取3次，合并上清液，过0.45μm滤膜后采用高效液相色谱检测虫草素含量，发酵液直接过0.45μm滤膜后，进行高效液相色谱检测。色谱条件［11］：色谱柱：Shim-pack vp-DS(150mm×4.6mm，5μm)；流动相∶V(水)∶V(甲醇)=85∶15，流速0.8mL/min；检测波长260nm，进样量10μL，柱温35℃。