3.1　溶剂体系的筛选

溶剂体系的选择是HSCCC分离中的关键环节，通常通过测定目标物质在溶剂体系中的K值来判断溶剂体系是否适合目标组分的分离。对于HSCCC分离，目标物质在两相溶剂体系中的K值最适范围为0.5～2.0［13］。根据虫草素的化学性质及常用的参考溶剂体系，实验中考察了蛹虫草发酵液中多个组分在多组溶剂体系中的K值，结果见表1。

表1　虫草素发酵液各组分在不同溶剂体系中的K值
Table 1　K values of different ingredients from C.militaris fermentation broth in various solvent systems

在表1中，保留时间(t R)为12.7min的组分物质为虫草素，其他两个组分在发酵液中相对量较高，为与虫草素t R较接近的组分物质。可知，目标物质虫草素在溶剂体系1和3中的K值均偏小，在分离过程中理论t R长，不易被流动相萃取出来，不适宜于虫草素的分离。虫草素在溶剂体系2中的K值在合适的范围内，但是各个组分的K值差别不大，各个组分不能很好地分离，利用分析型HSCCC试探其分离效果见图1-A，出峰时间快，分离得到的两个峰未能达到基线分离，不适宜发酵液中虫草素的分离。(https://www.daowen.com)

以醋酸乙酯代替正己烷，选择相对极性较大的溶剂体系醋酸乙酯-正丁醇-水(表1)，虫草素在溶剂体系4、5、6的K值均在适宜范围之内，利用溶剂体系4在分析型HSCCC上分离样品，分离色谱图见图1-B，各组分在溶剂体系4中已经开始有良好的分离趋势。对溶剂比例进一步进行调整，加大正丁醇比例，减小醋酸乙酯的比例(溶剂体系5)，在一定程度改善了K值，将此溶剂体系应用于分析型HSCCC分离样品，结果见图1-C，样品中各个组分基本达到基线分离，按谱图接收各个峰对应的洗脱液，用HPLC检测，确定峰3为虫草素峰，但是在260 nm波长下检测峰质量分数只有90%，在此溶剂体系条件下不能获得高纯度的虫草素产品。

图1　样品在不同溶剂体系中分离HSCCC色谱图
Figure 1　HSCCC chromatograms of samples in various solvent systems

由于虫草素为生物碱类物质，根据碱性化合物的特性，向溶剂体系中加入氨水调节分离环境中的p H值，以醋酸乙酯-正丁醇-0.5%氨水(2∶3∶5)为溶剂体系(表1中溶剂体系6)，虫草素对应的K值增大，且各个组分K值的大小差异也增大，经分析型HSCCC分离(图1-D)，样品各组分在溶剂体系6的条件下得到了基线分离，较溶剂体系5，各峰的分离度得到了较大的改善。因此，最终选择醋酸乙酯-正丁醇-0.5%氨水(2∶3∶5)为发酵液中虫草素的最佳分离溶剂体系。