实验二 基本操作技术Ⅰ（培养基的制备及灭菌）
一、实验目的
1.了解常用培养基的组成与制备方法。熟悉常用培养基的种类。
2.掌握高压灭菌锅的构造及使用方法。
二、实验材料
1.牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、琼脂、蒸馏水。
2.精密p H试纸、1N NaOH、1N HCL。
3.天平、高压灭菌锅、干热灭菌箱、电炉。
4.试管、三角烧瓶、烧杯、量筒。
三、实验原理
一般微生物的营养细胞在水中煮沸即可被杀死，但细菌的芽孢有较强的抵抗力，开水中煮沸30分钟，甚至1～2小时，也不能完全杀死。因此，有效彻底地灭菌需要更高的温度，并要求能在较短的时间内达到灭菌的目的。根据蒸汽的温度随压力增加而提高，压力越大，温度越高的原理，高压蒸汽灭菌是在密闭的高压蒸汽灭菌器内进行的。
加热使灭菌器内的水产生蒸汽，驱除器内的空气后使蒸汽不能逸出，从而增加灭菌器的压力。水的沸点和蒸汽的温度随之上升，因而能够获得比100℃更高的温度，用来进行有效的灭菌。常用1.05 kg/cm2的压力，在121.3℃温度下，维持15～20分钟即可杀死所有微生物，达到完全灭菌的目的。使用高压灭菌器进行灭菌时，灭菌器内冷空气是否排除完全极其重要，因为水蒸气中含有空气时，在同一温度下所达到的压力高于不含空气的水蒸气的压力，即在同一压力下的实际温度，含空气的水蒸气低于饱和蒸汽。
四、实验内容
（一）培养基及其配制
培养基：人工配制的含有细菌生长繁殖所需营养的基质，调整p H为7.2～7.6，并经灭菌后按量分装后即可使用（参照图1和图2）。
根据培养基的物理状态的不同分为液体、固体和半固体三大类。在液体培养基中加入1.5%～2.5%的琼脂粉，即凝固成固体培养基；琼脂含量在0.3%～0.5%时，则为半固体培养基。琼脂在培养基中起凝固作用，对细菌不具营养意义。液体培养基可用于大量增殖细菌，固体培养基常用于细菌的分离和纯化，半固体培养基则用于观察细菌的动力和短期保存细菌。
微生物的生存和生长依赖于可利用的养分和有利的生长环境。在实验室中，用于培养微生物的营养剂称为培养基。使用三种物理形式：液体或清汤、试管、半固态试管和固体试管。这些试管之间的主要区别是固体和半固体试管含有固化剂（通常是琼脂），而液体试管则没有。在发酵研究和各种生化试验中，可利用液体试管，如营养液、胰酶大豆肉汤或脑心输液汤传播大量微生物。半固态培养基也可用于发酵研究，测定细菌的活动性，促进厌氧生长。培养基的作用包括：①用于微生物表面生长以观察菌落的外观。②用于纯培养分离。③用于培养的储存。④观察特定的生化反应。
图1 琼脂平板的制备
图2 不同容器琼脂的制备
（二）灭菌方法
热力灭菌法分为干热灭菌和湿热灭菌两类，在同一温度下，湿热灭菌效果比干热灭菌效果好的原因是湿热环境下穿透力强，能较快提高灭菌物品的内部温度；湿热中细菌易吸收水分，使菌体蛋白质易于凝固变性；热蒸汽接触被灭菌物品时变为液态可放出大量的潜热，能迅速提高灭菌物品的温度。
1.干热灭菌法：包括火焰灭菌和热空气灭菌两类。
（1）火焰灭菌法是以火焰直接烧灼杀死物体中微生物的方法。对于接种环、接种针或其他金属用具，可直接在酒精灯火焰上烧至红热进行灭菌，此外在接种过程中，试管或三角瓶口，也可以通过火焰而达到灭菌的目的。
（2）热空气灭菌指利用干热灭菌器以干热空气进行灭菌的方法，常用于耐高温物品。灭菌条件为160℃维持l～2小时，这样才能杀死所有微生物（芽孢、孢子）。
另外，使用电烘箱干热灭菌时应注意以下问题：
1）灭菌物体在箱内不能堆放得太满，一般不超过总容量的2/3，灭菌物体间应留有一定的空隙。
2）灭菌物体不能直接放在烘箱的底板上，灭菌物体的包装物，如纸、棉花或纱布等不要接触烘箱内壁的铁板，因为铁板温度一般高于箱内空气的温度，容易烧焦着火。
3）升温时或灭菌物体有水分蒸发时可打开进气孔和排气孔，温度达到所需温度后就要关闭进气孔和排气孔，使箱内空气温度一致。(https://www.daowen.com)
4）灭菌温度控制在165℃维持l～2小时，超过170℃包装纸就变黄，超过180℃纸或棉花等就会烤焦或燃烧。如因不慎或其他原因导致烘箱内纸或棉花烤焦或燃烧的事故时，应先关闭电源，将进气孔和排气孔关闭，使其自行降温到60℃以下时才能打开箱门进行处理。切勿在未切断电源前打开箱门或排气孔，以免促进燃烧引起更大的事故。
5）正常情况下，灭菌完毕，让其自然降温到100℃以后，打开排气孔促使降温，降到60℃以下时再打开箱门取出灭菌物，以免骤然降温使玻璃器皿破裂。
2.湿热灭菌法：有煮沸灭菌、巴氏消毒、流通蒸汽灭菌、间歇灭菌、高压蒸汽灭菌几种。
（1）煮沸灭菌：煮沸10～20分钟可杀死所有细菌繁殖体，芽孢常需煮沸1～2小时才被杀死。手术器械、注射器、针头及食具等可用此法。
（2）巴氏消毒：以较低温度杀灭液态食品中病原菌或特定微生物，尽量保持其营养成分和风味的消毒方法。主要用于葡萄酒、啤酒、果酒及牛乳等食品的消毒。巴氏消毒具体方法有3种：
1）低温维持巴氏消毒（LTH）：63℃～65℃维持30分钟；
2）高温瞬时巴氏消毒（HTST）：71℃～72℃维持15秒；
3）超高温巴氏消毒法（UHT）：132℃维持1～2秒。
消毒后均须迅速冷却至10℃以下，促进细菌死亡，称为冷击法。超高温巴氏消毒的鲜乳在常温下，保存期可达6个月。
（3）流通蒸汽灭菌：是利用蒸汽在流通蒸汽灭菌器内进行灭菌的方法，100℃维持30分钟。
（4）间歇灭菌：100℃维持30分钟，37℃恒温箱过夜，连续进行3次灭菌和2次保温，达到完全灭菌目的。此灭菌法可用于不耐高温的培养基的灭菌。
（5）高压蒸汽灭菌：即用高压蒸汽灭菌器进行灭菌的方法，是应用最广、最有效的灭菌方法。高压蒸汽灭菌常用于培养基、溶液、器皿、器械、敷料、橡皮手套、工作服和小实验动物尸体等的灭菌。
高压蒸汽灭菌器有立式、卧式及手提式等不同类型，但其结构原理基本相同。手提式高压蒸汽灭菌器结构分4个部分。
1）外锅，供装水发生蒸汽用，外锅外侧一般均有石棉或玻璃棉的绝缘层，防止散热。
2）热源，高压蒸汽灭菌器一般都有加热装置，一般在底部装有电热丝加热。
3）内锅，或称“灭菌室”，是放置灭菌物体的空间。
4）压力表，有的压力表上标有三种单位，公制压力单位（kg/cm2）、英制压力单位（lbf/in2）和温度单位（℃）。
图3 高压灭菌锅
高压蒸汽灭菌器使用注意要点：
1）加水：使用前在锅内加入适量的水，加水不可过少，过少则容易将灭菌锅烧干，引起爆炸事故。
2）装锅：将灭菌物体放在搁架上，不要放得过满，盖好锅盖，注意盖正，然后将锅盖四周固定螺旋对称旋紧，打开排气阀。
3）加热排气：加热后待锅内沸腾，排气阀有大量的蒸汽冒出时，维持半分钟或一分钟，如灭菌物体较大或装有不容易透气的物品时，可适当延长排气时间，务必使空气充分排除，然后关闭排气阀。
4）保温保压：当压力达到1.05 kg/cm2，温度达到121℃时控制热源，保持压力，维持20分钟，切断电源。
5）出锅：当压力表降到0时打开排气阀，旋开固定螺旋，开盖，取出灭菌物品。注意：当锅内压力在0以上，温度在100℃以上时切勿开启排气阀，否则压力骤然降低，会造成培养基剧烈沸腾而冲出试管口或瓶口污染棉塞，以后培养时引起杂菌污染。
6）保养：灭菌完毕取出灭菌物品后将锅内的水倒出，保持内壁干燥，盖好锅盖。
五、实验注意事项
1.持证上岗。
2.灭菌锅使用前锅内要加水。
3.灭菌时人不得离开。
4.温度控制在121℃，压力15磅左右。