实验三 基本操作技术Ⅱ（无菌操作）
一、实验目的
1.掌握斜面培养基的无菌接种技术。
2.掌握平板的三区划线技术。
二、实验材料
试管、接种环、酒精灯，菌种斜面。
三、实验原理
微生物实验中的许多工作，都需要在无菌或不被杂菌污染的条件下进行才能保证做到纯培养。因此无菌操作是微生物学实验的一项重要的操作技术。虽然由于工作的目的和所用的材料不同，无菌操作的步骤有所差异，但在基本动作上是一致的。
四、实验方法
（一）无菌操作技术
1.用蜡笔给管子或盘子打上标签测试微生物（图1a）。(https://www.daowen.com)
2.将原培养管轻轻晃动，以便将细菌放入均匀的悬浮液中（图1b）。形成一个涡旋悬浮的微生物。
3.将菌种管放在一只手的手掌中接种。然后把管子分开，在手上形成V字形（图1c）。使它们保持在一个角度，这样试管口开放端不是垂直的，避免暴露在空气中，被实验室污染物污染。
4.用另一只手，把接种环或针放在火焰上燃烧直到电线热起来（图1d）
5.使用持有接种环的同一只手取下两个管上的盖子，保持他们在你的手指之间，并用火焰短暂地燃烧试管口（图1e），但不要让管子变红。
6.待接种环冷却，停止“嘶嘶声”后，用无菌接种环，将1滴培养液从培养管转移到新的清汤管中。在这一点上，你也可以转移到玻片，条纹表面的倾斜管，或条纹细菌的表面的培养皿（图1f）。当从斜面拿起细菌时，将其放在斜面顶部，直到它停止嘶嘶声，以此冷却热圈或针头。
7.重新填充管子的颈部（图1g）。
8.重新整理管子（图1h）。
9.重新填充或消毒环或针（图1i）。
图1 无菌操作技术
（二）试管的无菌接种技术（图2）
1.通过接种环，将黏质沙雷菌的培养转化为胰酶大豆肉汤琼脂斜面。
2.用接种针将黏质沙雷菌转移到一个胰酶大豆肉汤琼脂试管中。具体做法是在不接触试管壁的情况下，将黏质沙雷菌转移插入试管，穿透介质的深度。然后接种针从试管退出（图2a～2c）。
3.利用接种回路，进行偏斜转移。这是通过在倾斜的表面上以蛇形（摆动或s形）线条的形式来完成的。如果斜面底部有液体，则试管接种后可能倾斜，使液体流经斜面。这会滋润表面并扩散细菌（图2d）。
4.将试管放入试管架中，在35℃条件下孵化24～48小时。然后，检查所有的试管是否有细菌生长。
图2 试管的无菌接种技术
a～c穿刺接种技术，接种针不触及管壁直接穿刺至琼脂培养基卢。d在穿刺的基础上在培养基斜面波级接种。
（三）平板的无菌接种技术
1.在琼脂板上的底部标明要接种的细菌的名字、操作者的名字和日期。
2.小心地抬起培养皿的顶部，使其足够容易地插入接种环（图3a）。顶部应尽可能完全覆盖琼脂表面以避免污染。如图3b所示，插入细菌的接种环，并将其扩散到盘子边缘的一个小区域，以便有效利用琼脂表面。
3.第二区划线时，通过燃烧来杀死剩余的细菌，然后在盖子下插入回圈，在靠近琼脂边缘冷却。
4.旋转平板时，要仔细记住初始划线的终点（以有标记的象限为指南），并越过面积3条划线（图3b）。
5.旋转平板时，重复划线过程直至第三区划线完成（图3b，面积3）。
6.如果有必要，可以再次重复这个过程，以形成第四区（面积4）。这里使用的交叉比上一个象限要少。
7.在30℃～37℃的温度下，倒置24～48小时。然后，检查每一个琼脂板块，确定在3个或4个区域的分布和增长量，并在报告中记录你的结果。
图3准备一个平板，箭头表示回路的运动。在火焰和冷却的循环1和2，2和3，3和结束的连线。这样做的目的是，随着细菌的划线散开，使其在板块的每个连续区域中生长的细菌数量减少，从而使孤立的菌落在四区中出现。3区划线培养后的结果参照彩图1。接种后的菌落可参见图4。
图3 平板的无菌接种技术
图4 接种后长出的菌落