实验五　酵母菌细胞直接计数及细胞大小的测定

2026年07月28日

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一、实验目的

1.熟悉目镜测微尺和镜台测微尺的构造和使用原理。2.掌握显微测微尺测量微生物细胞大小的方法。

二、实验器材

1.菌种：热带假丝酵母、酿酒酵母。

2.试剂：香柏油、二甲苯和生理盐水等。

3.仪器或其他用具：光学显微镜、镜台测微尺、目镜测微尺、血细胞计数板、无菌毛细滴管、盖玻片、载玻片和擦镜纸等。

三、实验原理

（一）血细胞计数板记数原理

显微镜直接计数法是将小量待测样品的悬浮液置于具有确定面积和容积的红细胞计数板上，于显微镜下直接计数的一种简便、快速、直观的方法。显微镜直接计数法的优点是直观、快速、操作简单，但此法的缺点是所测得的结果通常是死菌体和活菌体的总和。

图1　血细胞计数板构造

红细胞计数板（图1）是一块特制的载玻片，其上由4条槽构成3个平台。中间较宽的平台又被一短横槽隔成两半，每一边的平台上各列有一个方格网，每个方格网共分为9个大方格，中间的大方格即为计数室。计数室的刻度一般有两种规格，一种是一个大方格分成25个中方格，而每个中方格又分成16个小方格；另一种是一个大方格分成16个中方格，而每个中方格又分成25个小方格，但无论是哪一种规格的计数板，每一个大方格中的小方格都是400个。每一个大方格边长为1 mm，则每一个大方格的面积为1 mm2，盖上盖玻片后，盖玻片与载玻片之间的高度为0.1 mm，所以计数室的容积为0.1 mm3。

计数时，通常数5个中方格的总菌数，然后求得每个中方格的平均值，再乘上25或16，就得出一个大方格中的总菌数，然后再换算成1ml菌液中的总菌数（图2）。

图2　血细胞计数板构造

如图2，设5个中方格中的总菌数为A，菌液稀释倍数为B，如果是25个中方格的计数板，则1 ml菌液中的总菌数=A/5×25×10000×B=50000A×B。同理，如果是16个中方格的计数板，1 ml菌液中的总菌数=A/5×16×10000×B=32000A×B。

（二）测量细胞大小的原理

微生物细胞的大小是微生物重要的形态特征之一，由于微生物细胞很小，只能在显微镜下测量，一般采用显微测微尺来测量。显微测微尺包括目镜测微尺和镜台测微尺两个部分。

目镜测微尺是一块圆形的玻片，在玻片中央把5 mm长度刻成50等份，或把10 mm长度刻成100等份。测量时，将其放在接目镜中的隔板上（此处正好与物镜放大的中间像重叠）来测量经显微镜放大后的细胞物像。由于不同的显微镜或不同的目镜和物镜组合放大倍数不同，目镜测微尺每小格代表的实际长度也不一样。因此，用目镜测微尺测量微生物大小时，必须先用镜台测微尺进行校正，以求出该显微镜在一定放大倍数的目镜和物镜下，目镜测微尺每小格所代表的相对长度，然后根据微生物细胞相当于目镜测微尺的格数，可计算出细胞的相对大小。

图3　目镜测微尺

镜台测微尺（图3）是中央部分刻有精确等分线的载玻片，一般将1 mm等分为100格，每一格长10μm（即0.01 mm），是专门用来校正目镜测微尺的。校正时，将镜台测微尺放在载物台上，由于镜台测微尺与细胞标本是处于同一位置，都要经过物镜和目镜的两次放大成像进入视野，即镜台测微尺随着显微镜总放大倍数的放大而放大，因此从镜台测微尺上得到的读数就是细胞的真实大小，所以用镜台测微尺的已知长度在一定放大倍数下校正目镜测微尺，即可求出目镜测微尺每格所代表的长度，然后移去镜台测微尺（图4）换上待测标本片，用校正好的目镜测微尺在同样放大倍数下测量微生物大小。

图4　镜台测微尺

四、实验方法

（一）细胞记数的方法

1.菌悬液制备：用无菌生理盐水将酿酒酵母制成浓度适当的菌悬液。

2.镜检血细胞计数板：在加样前，先对计数板的计数室进行镜检。若有污物，可用自来水清洗，再用吹风机吹干后才能进行加样。

3.加样品：将清洁干燥的血细胞计数板盖上盖玻片，再用无菌的毛细滴管将摇匀的酿酒酵母菌悬液由盖玻片边缘滴一小滴，让菌液沿缝隙靠毛细渗透作用自动进入计数室，一般计数室均能充满菌液。

4.显微镜计数：加样后静止5分钟，然后将血细胞计数板固定于显微镜载物台上，先用低倍镜找到计数室所在位置，然后换成高倍镜进行计数。

在计数前若发现菌液太浓或太稀，需重新调节稀释度后再计数。一般样品稀释度要求每小格内有5～10个菌体为宜。每个计数室选取5个中格（可选4个角和中央的一个中格）中的菌体进行计数。位于格线上的菌体一般只数上方和右边线上的。如遇酵母出芽，芽体大小达到母细胞的一半时，即作为两个菌体计数。计数一个样品要从两个计数室中计得的平均数值来计算样品的含菌量。

5.清洗血细胞计数板：计数完毕后，将血细胞计数板置于水龙头下用水冲洗干净，切勿用硬物洗刷，洗完后自行晾干或用吹风机吹干。镜检，观察每小格内是否有残留菌体或其他沉淀物。若不干净，则必须重复洗涤至干净为止。

（二）细胞大小的测量方法(https://www.daowen.com)

1.目镜测微尺的安装：取出目镜，把目镜上的透镜旋下，将目镜测微尺有刻度的一面朝下放在目镜镜筒内的隔板上，然后旋上目镜透镜，再把目镜插入镜筒内。

2.校正目镜测微尺（图5）：将镜台测微尺放在显微镜的载物台上，使有刻度的一面朝上。先用低倍镜观察、调焦距，待看清镜台测微尺的刻度后转动目镜，使目镜测微尺的刻度与镜台测微尺的刻度相平行。利用推进器移动镜台测微尺，使两尺在某一区域内两线完全重合，然后分别数出两重合线之间目镜测微尺和镜台测微尺所占的格数。

用同样的方法换成高倍镜和油镜进行校正，分别测出高倍镜和油镜下两重合线之间两尺分别所占的格数。

由于已知镜台测微尺每格长度为10μm，根据下面的公式即可计算出在不同放大倍数下，目镜测微尺每格所代表的长度。

图5　镜台测微尺的校正

例如，目镜测微尺20个小格等于镜台测微尺3小格，已知镜台测微尺每格为10 m，则3小格的长度为3×10=30 m，那么相应地在目镜测微尺上每小格长度为3×10÷20=1.5 m。

3.菌体大小的测定：目镜测微尺校正完后，将镜台测微尺取下，分别换上大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌和钩端螺旋体标本片，先在低倍镜和高倍镜下找到目的物，然后在油镜下测量金黄色葡萄球菌的直径、大肠埃希菌和钩端螺旋体的宽度和长度。量出细菌直径或长和宽所占目镜测微尺的格数，最后将所测得的格数乘以目镜测微尺（用油镜时）每格所代表的长度，即为该菌的实际大小。

一般测量菌体的大小要在同一个标本片上测定10～20个菌体，并求出平均值才能代表该菌的大小，而且一般是用对数生长期的菌体进行测定。

4、测量完毕：取出目镜测微尺，将接目测微尺和镜台测微尺分别用擦镜纸擦拭后放入盒内保存。

五、注意事项

1.取样时先要摇匀菌液，加样时计数室不可有气泡产生。

2.加样后菌体静止时方可计数，否则影响实验结果。

3.计数板上的计数室的刻度非常精细，清洗时请勿用刷子等硬物，也不可放到酒精灯火焰烘烤计数板。

4.观察时光线不宜过强，否则难以找到镜台测微尺的刻度。

5.换高倍镜和油镜时，防止物镜压坏镜台测微尺和损坏镜头。

6.校正目镜测微尺时要注意准确对正目镜测微尺与镜台测微尺的重合线。

六、实验报告

实验结果

（1）细胞记数结果：A为5个中方格中的总菌数；B为菌液稀释倍数。