实验四 细菌的革兰氏染色法
一、实验目的
1.熟悉显微镜的使用方法与保养。
2.掌握细菌革兰氏染色（Christain Gram）标本的制作和原理。
二、实验材料
1.葡萄球菌、大肠埃希菌18～24小时的培养物。
2.结晶紫、聚维酮碘、95%的乙醇、品红。
3.载玻片、酒精灯、接种环、生理盐水、吸水纸、显微镜等。
三、实验原理
通透性学说认为细菌细胞壁结构和组成不同，可以用革兰氏染色法把细菌分为两类，革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G-）。当用结晶紫初染后，所有细菌都被染成蓝紫色，碘作为媒染剂，它与结晶紫结合成结晶紫-碘的复合物，从而增加了细菌与染料的结合力。当用脱色剂处理时，两类细菌的脱色效果不同。G+细胞壁主要由肽聚糖形成的网状结构组成，壁厚、类脂质含量低，用乙醇脱色时细胞壁脱水，使肽聚糖层的网状结构孔径缩小，通透性降低，从而使结晶紫- 碘的复合物不易被洗脱而保留在细胞内，经脱色和复染后仍然保留初染的蓝紫色。G-则不同，由于细胞壁肽聚糖层较薄，类脂含量高，当脱色处理时，类酯被乙醇溶解，细胞壁通透性增加，使结晶紫 -碘的复合物比较容易洗脱出来，用复染剂复染后，细胞被染上复染剂的红色。所以，染色后呈紫色者为革兰氏阳性菌，染色后呈红色者为革兰氏阴性菌。葡萄球菌呈紫色，为G+菌；大肠埃希菌呈红色，为G-菌。
四、实验方法
结果参照书后彩图3、4、5。
1.细菌染色片的制作：涂片—干燥—固定。
2.革兰氏染色法
（1）初染：将结晶紫染液滴加到已固定的标本片上，染色1分钟，水洗。
（2）媒染：滴加碘液媒染1分钟，水洗。
（3）脱色：滴加95%的乙醇脱色，到无紫色为止，一般30秒，水洗。(https://www.daowen.com)
（4）复染：滴加品红复染1分钟，水洗，用洗水纸吸干，用油镜观察。
五、注意事项
1.标本片不能涂得太薄或太厚，以免影响实验结果。
2.革兰氏染色成败的关键在于脱色的时间长短。
3.染色过程中不要使染色液干涸，用水冲洗后应去除玻片上的残水，以免染色液被稀释而影响染色效果。
4.选用培养16～24小时的细菌为宜。
六、革兰氏染色法实际意义
1.鉴别细菌：将细菌分为G+和G-两类，便于初步识别细菌，缩小鉴定范围（图1～图3）。
2.选择用药：G+和G-对抗生素和化学制剂的敏感性不一样，大多数G+对青霉素、红霉素等敏感，而大多数G-对链霉素、氯霉素和庆大霉素敏感，临床上根据病原菌的革兰氏染色可选择有效的药物治疗。
3.致病特点：大多数G+主要以外毒素致病，大多数G-主要以内毒素致病。而且两者的致病机制和表现也不一样。
图1 大肠埃希菌
图2 葡萄球菌（对应彩图3～5）
图3 两菌混合染色