实验八 酶联免疫吸附试验（ELISA）——双抗体夹心法
酶免疫技术是以酶标记的抗体或抗原作主要试剂的免疫学检测方法，又可分为酶免疫组织化学技术和酶免疫测定两类，前者应用酶标记抗体与组织切片上的相应抗原反应，然后与底物作用形成有色沉淀，再通过光学显微镜加以观察。后者则通过标记的抗体（抗原）与相应的抗原（抗体）结合并使底物显色，以检测标本含有的相应抗原（抗体），常用的是酶联免疫吸附试验（ELISA）。
一、实验目的
1.熟悉ELISA夹心法的操作。
2.掌握酶ELISA的基本原理。
二、实验原理
酶联免疫吸附试验（ELISA）是检测溶液中抗原或抗体的特异而灵敏的免疫学检测方法。双抗体夹心法是常用的一种检测抗原的方法，其原理为：①抗体结合于固相载体表面而不失其活性。②抗体与酶标记物交联后仍保持其免疫活性和酶活性。③检测时，固相抗体首先与待测抗原结合，后者再和酶标抗体结合，随后加入相应底物后，可催化底物呈显色反应。反应液颜色的深浅与被测抗原的量相关。
在本实验中，以辣根过氧化物酶（HRP）标记抗体。当抗体与相应抗原结合后，标记的酶则可催化底物（四甲基联苯胺）起显色反应形成蓝色产物，从而指示特异性抗原抗体反应的存在。
三、实验材料
1.器材：50～250μl可调微量移液器与移液头、37℃培养箱、搪瓷盒、酶标专用架、洗瓶（含洗涤液）、吸水毛巾。
2.试剂：已包被抗体的酶标条，400μg/L抗原溶液，抗原稀释液，待测标本1号、2号、酶标抗体，洗涤液（p H7.2 PBS -Tween 20），底物A、B溶液，终止液。(https://www.daowen.com)
四、实验方法
1.取已包被抗体的酶标条扣入酶标专用架，分别在第1～6孔处各加入抗原稀释液100μl，第6、7孔处各加入400μg/L抗原溶液100μl，从第2～6孔处进行对倍稀释（最后在第2孔处吸出的100μl丢弃），在第8、9孔处各加入100μl待测标本1，在第10、11孔各加入100μl待测标本2。置酶标板于37℃恒温箱30分钟。
2.弃去孔内液体，以洗涤液注满孔内，置3分钟后甩干孔内液体，重复3遍。上述孔内再加入酶标抗体100μl。置37℃恒温箱30分钟。
3.弃去孔内液体，以洗涤液注满孔内，置3分钟后甩干孔内液体，重复洗涤4遍。
4.各孔均加底物A和底物B溶液各100μl混匀，置37℃10分钟左右加入终止液50μl，终止反应。
5.将酶标板置酶标仪上比色，以第1孔调零，在450 nm波长处读取光密度值（O.D值）。
6.结果判断：以O.D值为纵坐标，抗原标准浓度（0；12.5；25；50；100；200；400μg/L）为横坐标，在半对数坐标纸上画出标准曲线，再根据样品的平均O.D值在标准曲线上查出各自的含量。
五、注意事项
1.熟练掌握微量移液器的使用方法。
2.每次洗涤酶标本后都应尽量甩干孔中残液。加入洗涤液时应小心，勿使洗涤液溢出，流入周围孔中。