实验六 E花环形成试验
一、实验目的
1.掌握T淋巴细胞E花环试验的原理和正常值。
2.熟悉显微镜下E花环的形态和计数方法。
二、实验原理
人外周血T淋巴细胞表面具有绵羊红细胞受体，在体外一定条件下将人淋巴细胞与绵羊红细胞两者混合，可以形成以T细胞为中心，周围黏附着多个绵羊红细胞的花环，为E花环试验（erythrocyte rosette test）。应用最广的有总E花环试验（Et，t为total的缩写）和活性E花环试验（Ea，a为active的缩写）。Et代表被检标本中T淋巴细胞的总数，Ea则反映具有高亲和力绵羊红细胞受体的T细胞数，这部分T细胞的免疫学功能更能反映机体细胞免疫功能和动态变化。E花环试验主要用于了解机体细胞免疫功能。广泛应用于肿瘤免疫、移植免疫及免疫性疾病的研究，为一些疾病的诊断和防治提供免疫学方面的重要参考。
三、实验材料
1.肝素抗凝静脉血、Hanks'液（无Ca2+、Mg2+）p H 7.4～7.6、小牛血清、淋巴细胞分离液、1%绵羊红细胞悬液、0.8%戊二醛、瑞氏染色液。
2.吸管、毛细滴管、玻片、试管、水浴箱、水平离心机、显微镜。
四、实验方法
（一）淋巴细胞的分离
1.取2～3 ml肝素抗凝静脉血（加肝素200U/ml抗凝），用Hanks液稀释1倍，混匀。
2.取2～3 ml淋巴细胞分离液（Ficoll）加入15 mm×150 mm试管中。
3.用毛细滴管吸取稀释血液，在距分离液面上1cm处，沿管壁徐徐加入，使稀释血液重叠于分层液上。稀释血液与分层液体积比为2∶1。
4.2000转/分，水平离心20分钟，小心取出试管，管内分4层，自上而下依次为血浆、单个核细胞、颗粒白细胞、红细胞（图1）。
5.用毛细吸管轻轻插到血浆与分离液的界面层，沿试管壁周缘吸出富含淋巴细胞的灰白色层即单个核细胞层移入另一试管中。
6.加入5倍以上体积的Hanks液混匀，离心1500转/分，水平离心10分钟，弃去上清液，将沉淀细胞振摇重悬后加Hanks液同法洗涤2次。
7.最后用营养液配制成（1×106～2×106）ml细胞悬液。
（二）E花环形成试验
1.Et试验：将淋巴细胞悬液0.1 ml和绵羊红细胞0.1 ml混匀（细胞数合适比例为1∶100），37℃水浴10分钟，以低速离心500转/分，转动5分钟，再置4℃2小时或过夜。取出后弃去大部分上清液轻轻摇匀，加0.8%戊二醛2滴固定数分钟后涂片，自然干燥后加1滴瑞氏吉姆萨染色液覆以盖玻片，用高倍镜观察。凡淋巴细胞周围吸附3个或以上绵羊红细胞者为阳性花结细胞。(https://www.daowen.com)
2.Ea试验：将淋巴细胞悬液0.1ml和绵羊红细胞0.02 ml混匀（两者比例为1∶20），低速离心500转/分，5分钟，弃去大部分上清液后轻轻摇匀，加0.8%戊二醛2滴固定数分钟后涂片，其余程序同Et试验。
图1 淋巴细胞分离示意图
五、结果观察
油镜检查：淋巴细胞呈蓝色，SRBC呈红色围绕淋巴细胞形成花环，凡表面黏附有3个及以上SRBC者为花环形成细胞（即E阳性细胞）。计数200个淋巴细胞，算出花环形成百分率，并推测其T淋巴细胞百分率。一般正常值Et为50%～70%，Ea正常值为25%～35%。
六、注意事项
1.一定要用新鲜血，否则会影响细胞活性，且绵羊红细胞受体会从T细胞表面脱落。
2.向分离液管加血液时应沿试管壁缓缓加入，使血液与分离液形成明显的界面，小心放取试管，避免打乱界面，影响分离效果。
3.由于花环结合不牢固，振荡摇动太剧烈花环易破坏，振荡不够没有充分混悬影响计数。戊二醛固定前应充分混匀，否则戊二醛加入后将更难混匀（使SRBC成团）。
七、临床意义
（1）Ea-RFC下降，常见于细胞免疫功能低下者。
（2）Et-RFC增高，可见于甲状腺功能亢进症和甲状腺炎患者；Et-RFC增高，可见于重症肌无力患者和移植排斥反应患者（图2、图3）。
图2 小鼠血样本E t
（对应彩图12、13）
图3 人外周血样本的E t
（对应彩图12、13）