实验七 淋巴细胞转化实验
植物血凝素（PHA）和刀豆蛋白（Con A）等促有丝分裂原可非特异性地活化T细胞，使T细胞DNA和蛋白质合成增加。同时，T细胞的形态亦发生变化，转化为淋巴母细胞样形态。淋巴细胞活化过程中的代谢和形态变化均能在体外进行测定，称为淋巴细胞转化试验。在淋巴细胞转化试验中，最常用的促有丝分裂原是PHA。根据所测定的内容不同，淋巴细胞转化试验有形态学检测方法和同位素检测方法。本实验介绍形态学检测方法。
淋巴母细胞的主要特点：1.形态学改变：细胞体积明显增大，为成熟淋巴细胞的3～4倍。核膜清晰，核染色质疏松呈网状。核内见明显核仁1～4个。胞质丰富，嗜碱性，有伪足样突出。胞质内有时可见小空泡。
2.细胞内核酸和蛋白质合成增加。
3.细胞代谢功能旺盛。
利用淋巴母细胞的不同特点，目前有多种实验方法可用于淋巴细胞转化程度的检测。根据其形态学改变，可通过体内法和体外法检测；根据细胞内核酸和蛋白质合成增加的特点，可通过3H -TdR掺入法检测；根据细胞代谢功能旺盛的特点，可通过MTT法进行检测。
一、实验目的
1.掌握淋巴细胞转化实验的原理、方法及其应用。
2.熟悉淋巴母细胞的形态特征。
二、实验原理
体外培养的淋巴细胞在受植物血凝素（PHA）、刀豆蛋白（Con A）等非特异性有丝分裂原的刺激时，可转化为淋巴母细胞，称为淋巴细胞转化实验（lymphocyte transformation test，LTT）。淋巴细胞转化率的高低可反映机体细胞免疫水平，因此在临床上常作为检测细胞免疫功能的指标之一。
三、实验材料
1.细胞培养液、植物血凝素（PHA）、淋巴细胞分离液、Hanks液、瑞氏吉姆萨染色液。
2.肝素抗凝管、滴管、吸管、刻度离心管、试管、细胞培养瓶、玻片、镜油。
3.RPMI -1640培养液制备方法：
（1）RPMI -1640 20.8 g蒸馏水1800 ml。
（2）1mol/L HEPES 11.915 g（HEPES为N- 2-羟乙基哌嗪-N- 2-乙磺酸）
（3）将（1）和（2）分别溶解后混合在一起，补充蒸馏水至1920 ml，混匀后，用0.02μm或更小的微孔滤膜滤过消毒。分装每瓶100 ml，4℃保存。
四、实验方法
（1）取培养瓶（链霉素瓶洗净后高压灭菌），按无菌操作加入3～5 ml配好的RPMI -l640细胞培养液。
（2）用消毒注射器取肝素抗凝血0.3 ml（7号针头20滴）加入上述含培养液的培养瓶中。
（3）按每5 ml培养液加入5μg/ml PHA溶液0.2～0.3 ml，使培养基中PHA的浓度达到200～300μg/ml。置37℃恒温箱中培养72小时，培养期间每天振摇一次。
（4）培养结束，吸弃瓶内上清液，取Tris -NH4Cl溶液3 ml加入瓶内，充分混匀后移入离心管内，置37℃水浴10分钟。
（5）加适量生理盐水混匀，以1500转/分，离心10分钟，弃去上清液，共洗2次，摇匀沉淀细胞，推片、干燥，瑞氏染色。(https://www.daowen.com)
五、结果观察
根据细胞大小、胞核和胞浆特征等进行判别。转化过程中，常见的细胞类型有成熟淋巴细胞、过渡型淋巴细胞、淋巴母细胞（图1、图2）、核分裂相细胞等，其具体形态特征如下。
1.成熟淋巴细胞：①直径6～8μm。②核质紧密、无核仁。③着色较深。④胞质较少。
2.过渡型淋巴细胞：①体积较成熟淋巴细胞略大，直径为12～16μm。②核质较疏松，有或无核仁。③着色较淡。④胞浆增多、嗜碱性、空泡及伪足样突起可有可无。
3.淋巴母细胞：①体积明显增大，直径为12～20μm，是成熟淋巴细胞的3～4倍。②核疏松呈网状结构并有1～3个核仁。③核周有淡染区。④胞浆丰富呈嗜碱性，有伪足样突起，有时可见空泡。
4.核分裂相细胞：又称染色体型淋巴细胞，核呈有丝分裂，可见成堆或散在的染色体。
在油镜下观察计数200个淋巴细胞，根据淋巴细胞转化的形态学指标计算出淋巴细胞转化的百分率。其中，过渡型淋巴细胞、淋巴母细胞和核分裂相细胞作为转化细胞，正常值为60%～80%，低于50%为降低。
图1 小鼠血样本的淋巴母细胞
（对应彩图14、15）
图2 人外周血样本的淋巴母细胞
（对应彩图14、15）
六、注意事项
1.本实验要求严格进行无菌操作，否则会污染影响实验效果。
2.PHA的加入量要适当，过多或过少都会影响转化率。一般需根据不同的厂家、批号及实践经验定量。
七、临床意义
1.评价机体细胞免疫状态和探讨发病机制：转化率增高见于Down综合征下多见于原发或继发性细胞免疫缺陷或功能低下者。
2.判断肿瘤的疗效和预后：转化率正常提示预后良好，反之预后不良。
3.寻找迟发型超敏反应的变应原：为寻找由药物而引发的迟发型超敏反应的变应原，可将患者外周血淋巴细胞与可疑药物共同培养，若转化率高于对照组，即可判明病因。
4.选择适当的供体：在脏器移植时，为选择适宜的移植供体，可将受者与供者的淋巴细胞分离后在体外做单相或双相混合培养，如转化率增高，则不宜移植。