实验五 白细胞吞噬功能试验
具有吞噬功能的细胞称吞噬细胞，包括单核 -巨噬细胞及中性粒细胞。单核细胞存在于血液中随血液循环迁移至组织中定位，并分化成熟为巨噬细胞。巨噬细胞吞噬功能强，细胞内富含溶菌体及线粒体，具有杀伤细胞内病原体（细菌、真菌、寄生虫、病毒），吞噬、清除体内凋亡的细胞及异物等功能。中性粒细胞内富含溶酶体、过氧化物酶及杀菌物质，具有高度的移动性和吞噬功能。在异物入侵、炎症早期，中性粒细胞可从血管渗出，游走到病原体等异物入侵部位，发挥吞噬作用。
巨噬细胞能吞噬鸡红细胞，中性粒细胞可吞噬多种细菌，如葡萄球菌等。将巨噬细胞和中性粒细胞分别与鸡红细胞、表皮葡萄球菌混合，孵育一定时间后涂片染色镜检；见巨噬细胞可吞噬鸡红细胞；中性粒细胞可吞噬葡萄球菌，可计算出吞噬异物的细胞数和吞噬细胞中吞入的异物数。在巨噬细胞中亦可见到鸡红细胞发生形态改变。本实验以测定中性粒细胞吞噬功能为例加以介绍。
一、实验目的
1.熟悉中性粒细胞的吞噬作用原理和方法。
2.通过本实验理解机体的非特异性免疫机制。
二、实验原理
血液中的中性粒细胞，通过趋化、调理、吞入和杀菌等几个步骤，能吞噬和消化衰老、死亡细胞及病原微生物等异物，是机体非特异性免疫的重要组成部分。将新鲜血液分离来的白细胞和细菌混合，置37℃培养箱30分钟后涂片染色，即能观察到被吞噬细胞吞噬的细菌。
三、实验材料
1.葡萄球菌液。
2.抗凝人血（一滴3.8%枸橼酸钠加于无菌小试管中）6 ml、瑞氏吉姆萨染色液、双蒸水、淋巴细胞分离液、细胞培养液。
3.试管、玻片、采血针、酒精棉球、吸管、滴管、显微镜、一次性吸管和香柏油。
四、实验方法
1.静脉采血6 ml。
2.用白细胞分离液分离白细胞，1500转，5分钟离心洗涤2次。
3.加细胞培养液，葡萄球菌液适量混匀，置37℃培养箱30分钟，中途混匀一次。
4.取出小试管1500转，5分钟离心，弃去上清液后用一次性吸管将试管中细胞液混匀后涂薄片，自然干燥。
5.待涂片干后，用瑞氏吉姆萨染色。
6.瑞氏吉姆萨染色方法：取瑞氏吉姆萨染色液（A液）数滴滴于上述血片上先染1分钟，然后加2倍（B液）混匀，继续染5分钟，水洗，用吸水纸吸干后镜检。
瑞氏（wright）染色液的配制方法：
1.瑞氏（wright）染色液：瑞氏染料0.3 g加甘油3 ml，在研钵中研磨后加甲醇97 ml，放置1周后使用。
2.p H7.4磷酸盐缓冲液（PBS）
（1）A液：为0.2 mol/L磷酸二氢钠水溶液，Na H2 PO4·H2 O 27.6 g溶于蒸馏水中，最后补加蒸馏水至1000 ml。(https://www.daowen.com)
（2）B液：为0.2 mol/L磷酸氢二纳水溶液，Na H2 PO4·7H2 O 3.6 g加蒸馏水溶解，最后加水至1000 ml。
将A液19 ml、B液81 ml、Nacl 8.5 g用蒸馏水稀释至1000 ml即成p H 7.4的磷酸盐缓冲液（0.02 mol/L PBS）。
五、结果观察
1.油镜检查：寻找中性粒细胞或单核 -巨噬细胞，如果染色结果正确，可见细胞核及被吞噬的细菌染成紫色，而粒细胞的细胞浆则为淡红色（图1、图2）。
图1 单核 巨噬细胞吞噬的细菌
（对应书后彩图10）
图2 中性粒细胞吞噬的细菌
（对应书后彩图10）
2.计数：
（1）吞噬百分率：观察100个中性粒细胞，计算其中吞噬有细菌的中性粒细胞数，计算出吞噬细胞百分率。正常人吞噬百分比为62.77%±1.38%，吞噬指数为1.058±0.049。
（2）吞噬指数：观察100个中性粒细胞，计算其中被吞噬的细菌总数，平均每个中性粒细胞吞噬的细菌数即为吞噬指数。
六、注意事项
1.血涂片应薄厚均匀适中，避免过薄或过厚。
2.瑞氏染色液染色时间不能过长以免染色过重。
七、临床意义
1.判断两类吞噬细胞的吞噬功能和消化功能。
2.评价机体的免疫状态。
3.吞噬百分率和吞噬指数高表明机体免疫力强，反之，机体免疫力弱。