肝脏的免疫学特点
杨沐阳 沈关心
一、肝脏的免疫系统组成
肝脏是人体内最大的代谢和解毒器官，对维持机体代谢平衡起着重要作用，亦担负着重要的合成、转化、分解等作用。同时肝脏还具有重要的免疫功能，包含多种免疫细胞与分子。
肝脏细胞中有60%~80%为发挥代谢和解毒功能的肝细胞，也称肝实质细胞；20%~40%为肝非实质细胞，主要包括肝窦内皮细胞(liver sinusoidal endothelial cell，LSEC)、Kupffer细胞、胆管细胞、肝星状细胞和淋巴细胞等(图5-1)。肝窦内皮细胞和Kupffer细胞组成了肝网状内皮系统，在清除循环系统中大分子和微生物方面起重要作用。Kupffer细胞占人体内定居于组织巨噬细胞总数的80％～90％。据统计，人体的肝脏包含大约1010个淋巴细胞，它们大多分布在汇管区，其中NK细胞约占31%，B淋巴细胞约占6%，T淋巴细胞约占63%。非传统T淋巴细胞还包括NKT淋巴细胞、γδT淋巴细胞和其他细胞。
肝脏中的免疫细胞是肝非实质细胞的重要组成部分，分为固有免疫细胞与适应性免疫细胞。固有免疫细胞包括从外周迁移至肝脏的巨噬细胞、NK细胞、NKT淋巴细胞、树突状细胞(dendritic cells，DCs)、中性粒细胞、γδT淋巴细胞等，同时也包括在肝脏定居的固有免疫细胞，如Kupffer细胞、肝脏定居NK细胞(liver-resident NK cells，LrNK细胞)、HSC、LSEC等。适应性免疫细胞，包括T淋巴细胞与B淋巴细胞等。在HBV急性感染过程中，上述免疫细胞组成一支“交响乐队”，有效地发挥抗病毒效应；但无论在外周血还是肝脏，如果免疫细胞功能低下或缺陷，则不能有效地发挥抗病毒作用，将形成HBV慢性感染。
图5-1肝内细胞的组成
免疫细胞分泌的细胞因子在肝脏免疫中亦起关键作用。肝脏中细胞因子主要由免疫细胞产生，介导多种免疫和炎症反应，在细胞内外调节细胞的生化过程，并可作用于不同类型的细胞，发挥的作用可能相互重叠(表5-1)。在正常情况下，细胞因子的合成是极少量的，但是在细胞被生理或病理因素激活后细胞因子的分泌可明显增加。在病毒感染过程中，巨噬细胞可以分泌大量炎性细胞因子如TNF-α、IL-1β等，促进抗病毒免疫。CD4+T淋巴细胞主要分为Th1细胞、Th2和Th17细胞，Th1细胞主要产生IL-2和IFN-γ，激活细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocytes，CTLs)与巨噬细胞，参与细胞免疫应答，而Th2细胞能产生IL-10和IL-13，激活B淋巴细胞，产生抗体，参与体液免疫应答。Th1和Th2细胞亚群的细胞因子相互抑制，保持炎症局部的动态平衡。Th17细胞主要分泌IL-6和IL-17，参与炎症反应。
表5-1肝脏中主要的炎性细胞因子
HBV感染造成的免疫状态变化不同于其他病毒感染，其器官独特的免疫环境是该变化产生的原因之一。Kupffer细胞、LrNK细胞、HSC、LSEC等受到HBV的影响会发生功能改变，同时这些肝脏固有的免疫细胞也影响HBV的感染与复制。HBV感染后会经历一个迟发的病毒复制和传播期，而慢性感染表现为典型的高病毒载量、高病毒蛋白量，这与HIV、HCV、HCMV等病毒不同。以上因素塑造了HBV感染独特的免疫学特点。下面从固有免疫与特异性免疫两个方面介绍肝脏的免疫学特征。
二、肝内的固有免疫
固有免疫(innate immunity)亦称天然免疫(natural immunity)或非特异性免疫(non-specific immunity)，是种群长期进化过程中逐渐形成的，是机体抵御病原体侵袭的第一道防线。其特点是个体出生时即具备、作用范围广、并非针对特定抗原。有效的病毒控制需要固有免疫和适应性免疫的协作，固有免疫作为机体防御的第一道防线能够快速识别病毒核酸、蛋白质等成分，启动一系列抗病毒反应，如诱导Ⅰ型干扰素的产生，通过NK细胞直接杀伤病毒感染细胞，降低感染细胞数量，产生促炎性因子和趋化因子，促进适应性免疫细胞成熟并募集到感染部位，有效的固有免疫应答能够在适应性免疫应答启动之前有效地控制病毒扩散。不同的病原微生物感染亦可导致不同的临床转归，为了逃避宿主的免疫系统识别与清除，很多病毒进化出了不同的逃逸策略，HBV已经发展了特有的策略躲避免疫系统的识别和清除。
现代免疫学突破性进展之一是发现固有免疫也具有识别功能，其识别的主要是病原微生物及其产物共有的保守结构，统称为病原体相关分子模式(pathogen associated molecular patterns，PAMPs)。其识别成分主要包括革兰阴性菌的脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)，革兰阳性菌的脂磷壁酸(LTA)和肽聚糖(peptidoglycan，PGN)，某些病毒和真菌成分及细菌DNA、双链RNA等。此外，固有免疫系统在某些情况下可识别自身受损、坏死、凋亡、突变及老化的细胞，及其释放的内源性分子，称之为损伤相关分子模式(damage-associated molecular patterns，DAMPs)，固有免疫细胞识别PAMP称为模式识别，介导模式识别的受体被统称为模式识别受体(pattern recognition receptors，PRRs)。
1.模式识别受体
病原体相关分子模式(PAMPs)是微生物表面存在而人体宿主一般不存在的一类结构稳定且进化保守的分子结构。PAMPs是病原体赖以生存所必需的，如细菌的脂多糖和病毒的双链RNA。宿主存在一类能识别PAMPs的受体，被称作模式识别受体(PRRs)，是识别PAMPs并引发免疫反应清除病原体的重要分子。细胞质型、膜型、可溶型PRR，分别表达于体内多种固有免疫细胞胞质、细胞表面或体液中，其特征如下：由胚系基因编码，多样性有限；同一类型细胞，如树突状细胞、巨噬细胞等所表达的 PRR 具有相同特异性，即非克隆表达；可识别一种或多种PAMP；介导快速生物学反应，效应细胞一旦识别 PAMP，PRR与PAMP结合后无须细胞增殖，即立刻被激活并发挥效应。
肝脏细胞可以表达PRRs，主要包括Toll样受体(TLRs)，这些分子和相应的信号通路，参与肝脏的抗感染、损伤与修复，涉及许多肝病的发病机制。
1)Toll样受体(TLRs)
1984年研究者在果蝇体内发现了一种胚胎发育所必需的蛋白，被命名为“Toll样受体”。在对昆虫的免疫研究中发现，TLRs能够识别微生物抗原，激活下游通路释放抗菌肽和果蝇菌素等物质，从而有效抵御微生物。随后在包括人在内的各种动物体内都发现了TLRs或类似分子。
迄今为止，研究者在人体中发现了10种TLRs，它们广泛表达于树突状细胞、巨噬细胞、中性粒细胞与B淋巴细胞，其中TLR-1、TLR-2、TLR-4、TLR-5、TLR-10表达于细胞表面，TLR-3、TLR-7、TLR-8、TLR-9表达于胞内中。TLR-3、TLR-7、TLR-8、TLR-9可以识别病毒感染细胞中病毒及细胞死亡后释放的核酸，通过TRIM-TRAM与MyD88-MAL下游信号通路激活NF-κB，从而激活抗病毒反应，在机体抗病毒过程中发挥重要作用。在乙型肝炎病程中，上述四种TLRs已被证实在抗HBV免疫中扮演重要角色。2007年Wu等在小鼠细胞中发现TLR-3、TLR-7、TLR-8、TLR-9的激动剂可以促进抗病毒细胞因子的产生，TLR-3刺激后的Kupffer细胞和LSEC能抑制肝细胞内HBV的复制。然而在临床应用上TLRs激动剂的效果不佳：一项口服TLR-7激动剂(GS9620)治疗HBV的临床试验证明，GS9620不能显著降低患者的HBsAg与HBV DNA水平，而其治疗效果受到ISG15基因的影响。最新研究发现新型TLR-7与TLR-8共激动化合物(如2，4-二氨基喹唑啉、嘧啶类化合物)能治疗HBV感染，但其结果还需要进一步证明。
2)其他受体
除TLRs外还有多种类型的PPRs，包括甘露糖受体(mannose receptors，MRs)、清道夫受体(scavenger receptors，SRs)、维甲酸诱导基因蛋白Ⅰ样受体(RLRs)、核苷酸结合寡聚化结构域NOD样受体(NOD-like receptors，NLRs)、蛋白激酶R(protein kinase R，PKR)、DNA依赖的干扰素调节因子激活物(DNA-dependent activator of interferon regulatory factors，DAIs)、C型凝集素受体(C-type lectin receptors，CLRs)和黑色素瘤缺乏因子2样受体(AIM2-like receptors，ALRs)等，其中SRs中的SRA被证明可以通过减弱TRAF3的泛素化抑制干扰素对HBV的治疗效果。
2.固有免疫细胞
肝脏内的固有免疫细胞多种多样，在HBV感染过程中发挥不同的作用，并且存在相互作用，参与形成HBV微环境免疫网络。肝脏内的固有免疫细胞主要分为外周来源的固有免疫细胞和在肝脏定居的固有免疫细胞两大类。
1)外周来源的固有免疫细胞
在生理条件下肝脏中的免疫细胞多为肝脏定居的免疫细胞，而当HBV感染机体后，大量外周来源的固有免疫细胞迁移至肝脏，参与针对HBV的炎症反应。由于HBV感染大多呈现慢性过程，外周来源的固有免疫细胞会持续迁移至肝脏，容易发生细胞因子风暴，诱发重型肝炎；同时长时间的炎症反应会激活相关癌基因，诱导肝癌的发生。HBV感染过程中外周来源的固有免疫细胞包括巨噬细胞、中性粒细胞、树突状细胞、NK细胞、NKT淋巴细胞、γδT淋巴细胞等。
(1)巨噬细胞：巨噬细胞是一类由单核细胞发育而来，具有强大吞噬及抗原呈递能力的细胞。其主要功能是通过PRRs等受体识别并吞噬病原体及相关抗原，通过吞噬体中的生物酶消灭病原体，并呈递抗原和分泌细胞因子，从而激活T淋巴细胞。
人和小鼠的外周巨噬细胞的标志分别为CD14+CD16+/-CCR2+和CD11bhighF4/80+。在HBV感染机体后，肝内细胞分泌的趋化因子与外周细胞表面趋化因子受体结合，大量外周巨噬细胞向肝脏局部转移。巨噬细胞能够被病毒直接活化，或者被NK细胞、NKT淋巴细胞以及T淋巴细胞来源的细胞因子活化，活化的巨噬细胞释放大量具有直接抗病毒作用的细胞因子(IFN-α/β、TNF-α)和具有免疫调节作用的细胞因子(IL-1、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12、GM-CSF)。
巨噬细胞存在极化现象，即在受到外界不同刺激的情况下分化成两种不同类别的亚型。巨噬细胞可以极化为M1型和M2型，其中M1型巨噬细胞膜表面表达促炎分子并分泌炎症因子如IFN-γ、TNF-α等，通过接触或非接触的方式激活效应细胞，发挥炎性功能；而M2型巨噬细胞表达IL-4、IL-10、TGF-β等免疫抑制性细胞因子，发挥免疫负向调节、维持免疫平衡的作用。在HBV感染过程中，肝内外周来源的巨噬细胞多为M1型，其促进肝脏微环境的抗病毒效应，同时在肝内持续炎症和细胞因子风暴中扮演重要角色。
巨噬细胞等固有免疫细胞广泛存在于一类参与炎症和焦亡的多蛋白复合物，称“炎症小体”。炎症小体由胞质内PRRs参与组装，能有效识别PAMPs和损伤相关分子模式(DAMPs)，激活促炎症蛋白酶Caspase-1，最终产生IL-18、IL-1β、IL-37等炎症因子。现今发现的炎症小体有5种：NLRP1、NLRP3、NLRC4、IPAF和AIM2。研究发现在慢性HBV感染过程中，NLRP3炎症小体受到抑制，由LPS刺激表达的NLRP3与IL-1β水平显著低于未感染组，此过程由HBeAg介导，抑制NF-κB活化和活性氧(reactive oxygen species，ROS)的产生。通过外部干预对NLRP3炎症小体活性进行恢复将可能成为增强抗病毒免疫、治疗HBV的新方法。
巨噬细胞在高HBV DNA载量的情况下可以接收HBV刺激并迅速发挥抗病毒效应，但与其他固有免疫细胞一样，在HBV感染初期巨噬细胞对HBV的敏感性较低，上述现象可能是乙型肝炎窗口期较长、容易发展成慢性疾病的原因之一。在HBV感染过程中，迁移至肝脏的外周巨噬细胞可能存在不同的亚型(非极化类亚型)，其作用可能也不尽相同。一种表型为CD14+HLA-DRhiCD206+巨噬细胞在慢性肝炎患者中表达的炎症因子水平显著高于CD14+CD206-巨噬细胞，这类巨噬细胞直接影响病毒复制与病毒特异性的T淋巴细胞功能。
(2)中性粒细胞：中性粒细胞是炎症早期大量浸润炎症局部的吞噬细胞，吞噬病原体后通过吞噬小体中的毒性蛋白、肽段及酶类杀死病原体。中性粒细胞在抗感染免疫中发挥重要作用，同时是急性炎症损伤与一些自身免疫病的罪魁祸首之一。所以研究中性粒细胞趋化至炎症局部、限制炎症反应的相关分子机制对解决中性粒细胞诱发的疾病意义重大。
人和小鼠中性粒细胞分别表达CD13、CD15、CD33和CD11b、CD13、CD33、Ly6G。中性粒细胞存在异质性，在不同刺激下可以诱导成表型不同的亚群。在炎症情况下，CD66b+CD10-的不成熟中性粒细胞快速迁移至炎症局部并转变为成熟的炎性亚群，同时还分化出具有免疫抑制作用的低密度中性粒细胞(LDNs)，维持局部免疫平衡。LDNs参与细菌、真菌以及病毒感染免疫，通过分泌精氨酸酶-1(arginase-1，ARG1)抑制CD4+和CD8+T淋巴细胞的增殖和IFN-γ的产出。在炎症局部也存在表达免疫检查点分子PD-L1的中性粒细胞，通过结合CD8+T淋巴细胞表面的PD-1分子诱导CD8+T淋巴细胞凋亡，从而抑制细胞免疫。而在肝脏炎症后组织修复的过程中，中性粒细胞通过ROS通路诱导具有炎性作用的Ly6ChiCX3CR1lo单核巨噬细胞转变为免疫抑制性的Ly6CloCX3CR1hi巨噬细胞，促进肝脏组织修复。另外，中性粒细胞还可以通过将miRNA-223转入巨噬细胞来抑制巨噬细胞炎性，缓解肝脏炎症。
生成中性粒细胞胞外诱捕网(neutrophil extracellular traps，NETs)是中性粒细胞抗病原微生物、发挥炎性作用的重要途径。NETs是中性粒细胞释放的细胞核染色质与骨架蛋白构成的网状结构，在中性粒细胞受到病原微生物的刺激后产生，形成方式有中性粒细胞死亡(NETosis)和非溶解死亡(non-lytic NETosis)两种。所释放的网状结构能够捕获病原微生物并通过网上的各种酶类杀灭病原微生物。在HBV感染过程中，HBV-C蛋白和HBV-E蛋白可以下调中性粒细胞的ROS和自噬能力，从而抑制NETs的释放，降低NETs的抗病毒功能，这是HBV早期感染逃避天然免疫监视的途径之一。
(3)树突状细胞(DCs)：DCs是专职的抗原呈递细胞(antigen-presenting cells，APCs)，吞噬抗原后经过加工形成MHC-抗原肽复合物并结合能识别抗原的T淋巴细胞，从而使初始T淋巴细胞增殖分化。同时DCs也是体内重要的免疫调节细胞，可通过分泌不同的细胞因子参与固有免疫和适应性免疫应答。DCs还参与移植排斥反应、感染、自身免疫性疾病等的发生和发展，以及肿瘤免疫。
DCs的特征标志是CD11c分子，其主要有四种亚型：由共同髓样祖细胞(common myeloid progenitors，CMPs)分化而来的常规DCs(conventional DCs，cDCs)、朗格汉斯细胞(Langerhans cells，LCs)、单核细胞来源DCs(monocyte-derived DCs，moDCs)，以及由共同淋巴样前体细胞(common lymphoid precursors，CLPs)分化而来的浆细胞样DCs(plasmacytoid DCs，pDCs)。cDCs是体内最常见的DCs，广泛存在于脾、淋巴结、骨髓以及一些非淋巴器官，主要承担抗原吞噬与呈递、激活T淋巴细胞的作用，其中又分为CD8α+CD103+和CD11b+两个主要亚群。LCs是存在于皮肤表皮和棘细胞间或胃肠道上皮的未成熟DCs，表面高表达MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ、FcγR等，在体外能刺激T淋巴细胞增殖分化。LCs受到局部炎症分子刺激后各类第一、第二信号分子表达上调，特征性分子CD1a消失，并可能向附近淋巴结迁移。moDCs是炎症状态下由单核细胞快速分化而来的一类DCs，表面表达CD64和FcγRⅠ，可大量分泌TNF-α和iNOS，促进形成炎症环境。而CLPs分化而来的pDCs与上述cDCs有着很大的区别：pDCs形态类似于浆细胞，不表达CD11b，特征性标志为CD45RA、唾液酸结合性免疫球蛋白样凝集素H(sialic acid-binding immunoglobulin-like lectin，SIGLECH)和血液抗原2。pDCs抗原呈递能力很弱，主要作用是在病毒感染过程中识别病毒抗原并分泌大量Ⅰ型感染素以促进抗病毒免疫。
DCs在急性HBV感染时大量募集到肝脏局部，呈递抗原，刺激T淋巴细胞进而激活抗病毒免疫，抑制病毒复制。然而，在慢性HBV感染过程中外周血中DCs的数量下降，抗原呈递和炎症因子产出能力均下降，其中IL6ST基因、免疫检查点与TLRs的表达量是DCs功能变化的可能原因。在DCs中pDCs是抗病毒的重要亚群，受到病毒刺激后主要通过分泌IFN等促炎性细胞因子活化刺激T淋巴细胞。尽管其抗原呈递能力较弱，但通过将HBc/HBs抗原体外负载pDCs可以有效增强HBV感染转基因小鼠中HBV特异性CD8+T淋巴细胞的功能，有效降低体内HBV DNA载量。HBV也可通过各种途径“攻击”pDCs，使其TLR-9和Ⅰ型干扰素表达降低，抑制其炎性作用。如何保护pDCs并促进其抗病毒功能是慢性乙型肝炎病理机制研究和抗病毒治疗中需要解决的问题。
(4)NK细胞：NK细胞发挥杀伤功能不需要预先免疫或致敏，故取名为NK细胞。NK细胞不仅对癌细胞、病毒、胞内寄生菌和老化变异细胞具有极强的清除能力，在某些情况下还会参与超敏反应和自身免疫性疾病的发生。NK细胞能够识别并杀死病毒感染细胞，这种效应功能是由NK细胞活化性受体(AKR)和抑制性受体(IKR)之间的平衡决定的。病毒感染造成感染细胞表面MHC-Ⅰ类分子缺失或者表达异常，导致IKR无法识别，同时宿主或者病毒编码的活化性配体结合AKR导致其活化，两者综合后最终促使NK细胞分泌颗粒酶和穿孔素杀伤病毒感染细胞。另外，NK细胞也可以被病毒感染时大量产生的细胞因子如IFN-α、IL-12和IL-18等直接活化。
NK细胞的特征标志为CD3-CD16+，可分为CD56bright和CD56dim两大亚群。近年来发现各个器官中都有定居的NK细胞，且它们的标志和功能有差异，其中肝脏定居的NK细胞在肝脏代谢和疾病进展中起到重要作用。在NK细胞表面表达一类杀伤细胞凝集素样受体(killer cell lectin-like receptor，KLR)，而CD94/NKG2复合物是其中之一，通过结合MHC-Ⅰ类分子发挥细胞毒调节功能。其中NKG2A为抑制性调节分子，NKG2C和NKG2D为活化性调节分子。
在HBV急性感染期尽管促炎性细胞因子产生受阻，但在肝内NK细胞仍能够很好地定位并应答。肝细胞表达较低的MHC-Ⅰ类分子，因此能够上调肝细胞表达NK细胞活化受体配体的刺激都能够诱导NK细胞发挥效应，而且在正常肝内NK细胞大量聚集，占肝内淋巴细胞的30%~40%。临床观察到急性HBV感染最早能检测到病毒抗原和DNA时，外周循环中NK细胞数量增加，但是随着病毒载量的增加，NK细胞的活化和功能受到抑制，到病毒清除时才恢复到高峰。NK细胞活化和功能抑制与IL-10的产生呈良好的时间相关性。同时HBV能诱导产生免疫抑制性的单核细胞，这种单核细胞又能诱导产生表达IL-10的调节性NK细胞，从而改变HBV感染的微环境。HBV持续感染还能上调NK细胞表面Siglec-9分子的表达，导致NK细胞功能受到抑制，这些均证明HBV能够躲避固有免疫反应。有研究显示，在旱獭模型中，病毒感染早期(8~12h)能够检测到NK细胞表面活化受体NKp46的高表达，说明NK细胞参与病毒感染最早期的反应。NK细胞在HBV慢性感染中的细胞毒功能没有缺陷，是完整的甚至是增强的，但分泌抗病毒细胞因子IFN-γ的能力却降低，从而造成病毒持续复制，肝损伤加重。在HBeAg阴性患者的研究中同样发现，当病毒波动时，NK细胞在促炎性细胞因子IFN-α和IL-8刺激下高表达TRAIL，介导肝细胞凋亡。
(5)NKT淋巴细胞：NKT淋巴细胞是一群既表达αβTCR，又表达NK细胞表面标志的特殊T淋巴细胞亚群，可分为CD4+NKT淋巴细胞和CD8+NKT淋巴细胞两个亚群，其中CD8+ NKT淋巴细胞具有CTL和NK细胞双重细胞毒性。NKT淋巴细胞主要分布于肝、骨髓、胸腺、脾及外周血中。各器官所含有的NKT淋巴细胞的比例、分型及激活后的表型亦不同。人体肝脏内富含NKT淋巴细胞，肝脏中NKT淋巴细胞占总T淋巴细胞的30%～50%。肝脏内高比例的NKT淋巴细胞可能在控制肝脏各种感染过程中发挥重要作用，可以快速地对感染和损伤做出反应，表现为快速地分泌大量不同类型的细胞因子，如Th1型、Th2型和Th17型细胞因子，又和肝组织内其他类型的细胞相互作用。同时NKT淋巴细胞通过细胞表面分子(如FasL、CD40L)表达和释放细胞颗粒内介质激活或损伤肝组织内其他细胞，因而NKT淋巴细胞不仅具有清除肝组织内一些病原体的功能，同时在各种肝病的发病机制中也有一定的作用。NKT淋巴细胞活化后能迅速产生高水平的IFN-γ，且其细胞毒活性亦增强，因此NKT淋巴细胞具有抗病毒的潜能。
NKT淋巴细胞根据其识别抗原呈递分子的不同可分为Ⅰ型NKT淋巴细胞和Ⅱ型NKT淋巴细胞。Ⅰ型NKT淋巴细胞表达恒定的TCR(如小鼠Vα14-Jα18、人类Vα24-Jα18)，限制性识别CD1d分子呈递的脂类抗原，如α-半乳糖基神经酰胺(α-galactosylceramide，α-GalCer)、分泌Ⅰ型和Ⅱ型细胞因子；而Ⅱ型NKT淋巴细胞不受限于CD1d分子，表达可以识别一系列脂质抗原的TCRs。肝内NKT淋巴细胞在联系固有免疫和适应性免疫、抗病毒、抗细菌感染、抗肿瘤中发挥着重要作用。
肝内的大部分NKT淋巴细胞是CD4+T淋巴细胞，但与其他T淋巴细胞亚群相比，NKT淋巴细胞具有独特的限制性表达的TCR库；传统的CD4+T淋巴细胞与MHC-Ⅱ类分子呈递的抗原结合，而NKT淋巴细胞接受CD1d分子呈递的脂类抗原，NKT淋巴细胞被激活后产生Th1/Th2细胞分泌的代表性促炎性细胞因子IFN-γ和IL-4等，以及表现出NK细胞的杀伤活性和穿孔素途径的细胞毒效应。有研究显示，给小鼠注射NKT淋巴细胞的配体后，可以快速地激活肝内NKT淋巴细胞，并能引起肝损害，而NKT淋巴细胞缺陷小鼠的肝损害显著降低。NKT淋巴细胞参与了多种肝病的进展，如NKT淋巴细胞非特异性地参与急性乙型肝炎患者早期HBV的清除，加速HBV相关性肝纤维化的进展等。
当HBV感染机体时，肝脏内存在的Ⅰ型NKT淋巴细胞接受CD1d分子呈递的来源于HBV及亚病毒颗粒中的糖脂及磷脂类抗原而活化，发挥抗病毒效应。在病毒诱导产生的细胞因子作用下亦可间接活化NKT淋巴细胞。活化的NKT淋巴细胞通过分泌细胞因子，以及通过活化其他淋巴细胞发挥抗HBV作用。NKT淋巴细胞介导的抑制病毒复制作用优于病毒抗原特异性介导的适应性免疫应答。特别是在慢性HBV感染过程中，由于免疫耐受的存在，在还不能成功获得HBV特异性T淋巴细胞应答的情况下，通过激活固有免疫应答来治疗HBV感染具有一定的应用前景。此外，激活后的NKT淋巴细胞亦可迅速分泌大量Th1型和Th2型细胞因子，亦在HBV感染肝细胞损伤中起一定作用。
有研究显示，尽管慢性乙型肝炎患者肝脏中CD1d分子表达增多，但NKT淋巴细胞的抗病毒功能随着病情发展、HBsAg的增多而受到影响，并呈现对α-GalCer的低反应性。NKT淋巴细胞在抗病毒的同时，对肝脏修复有着负面影响，同时产生IL-4和IL-13，促进HSCs活化，诱导肝硬化的发生。所以在HBV感染的不同时期监控并干预NKT淋巴细胞有助于慢性乙型肝炎患者病情的缓解。已有研究证明，通过阻断NKG2D分子可以有效抑制HBV感染中非经典NKT淋巴细胞的活化，减轻肝脏损伤。
(6)γδT淋巴细胞：γδT淋巴细胞是T淋巴细胞的一个亚群，其TCR由γδ链组成，多样性较低，主要识别未被处理的多肽抗原以及CD1所呈递的某些非多肽抗原。αβT淋巴细胞专一地依赖胸腺发育成熟，而γδT淋巴细胞能在胸腺外组织产生，如正常鼠的中枢神经系统(central nervous system，CNS)，从而推测γδT淋巴细胞是胸腺非依赖性的。目前的研究表明，γδT淋巴细胞来自胎儿时期的胸腺，后来才扩展到外周组织，缺乏胎儿时期胸腺起源的γδT淋巴细胞的无胸腺裸鼠无法被感染肠道的大肠埃希菌诱导产生相应的γδT淋巴细胞，在CNS中增殖的γδT淋巴细胞也可能起源于胸腺，它在T淋巴细胞循环过程中选择性地定位到了CNS，并在那里增殖。由此可见，γδT淋巴细胞起源于胸腺并在胸腺外器官增殖。还有一些学者认为γδT淋巴细胞的产生有胸腺源性和肠源性两种方式，肠源性γδT淋巴细胞直接从骨髓迁移到小肠上皮并在那里增殖。
γδT淋巴细胞多为CD4-CD8-双阴性细胞(部分为CD8+)，在外周T淋巴细胞库中所占比例较少，仅占外周血成熟T淋巴细胞的2%~7%，其广泛分布于皮肤和黏膜下，或存在于胸腺内。一部分γδT淋巴细胞表达低中水平的CD8分子，而CD4+γδT淋巴细胞非常罕见。在小鼠和鸡的肠道表皮，γδT淋巴细胞占所有T淋巴细胞的60%~80%，人类γδT淋巴细胞相比之下分布广泛且和αβT淋巴细胞共存。γδT淋巴细胞的特殊分布似乎预示了其特殊的免疫功能。值得注意的是，肝内聚集着大量的γδT淋巴细胞，占肝内T淋巴细胞的15%~25%，肝脏是体内γδT淋巴细胞最丰富的来源，在人肝内主要是一群Vδ3阳性的γδT淋巴细胞。γδT淋巴细胞是机体非特异性免疫防御的重要组成部分，尤其在皮肤黏膜局部及肝脏抗感染免疫中发挥重要作用，也参与机体免疫监视及免疫自稳。在功能发挥方式上，γδT淋巴细胞有Th细胞和CTL的双重细胞效应，它可在不同性质的微生物抗原刺激下，分泌Th1型和Th2型细胞因子，直接识别靶细胞表面抗原后产生细胞毒效应。
在病毒性肝炎患者肝脏中，研究者发现γδT淋巴细胞水平上升。有研究显示病毒性肝炎患者肝内有大量的γδT淋巴细胞浸润，其亚型主要为Vδ1 和Vγ9Vδ2 T淋巴细胞，而正常肝脏不表达γδT淋巴细胞。γδT淋巴细胞可能在对抗病毒和细菌感染以及对抗肿瘤形成的天然防御中发挥重要作用。因此，肝内上升的γδT淋巴细胞水平也可能在对抗病原体和转化细胞的天然防御中发挥重要作用。但在慢性HBV感染时，患者Vδ2T淋巴细胞频率降低，杀伤功能降低，分泌IFN-γ水平降低。在乙型肝炎相关慢加急性肝衰竭(HBV-ACLF)患者中观察到γδT淋巴细胞频率降低，但杀伤活性和分泌细胞因子的能力显著增加，提示γδT淋巴细胞可能参与了肝损伤过程。在长期HBV感染过程中γδT淋巴细胞也会发挥免疫负调节功能，促进髓系来源的抑制细胞(myeloid-derived suppressor cells，MDSCs)的免疫抑制功能，参与慢性乙型肝炎CD8+T淋巴细胞耗竭的过程。
(7)黏膜相关恒定T细胞(mucosal associated invariant T cell，MAIT细胞)：1993年，科学家在人外周血中发现了一类表达TRAV1-2和TRAJ33的T淋巴细胞，其在肠道黏膜中大量分布，故被称作黏膜相关恒定T细胞。MAIT细胞不具有常规T淋巴细胞表面多态性的TCR，识别APC表面的非多态性MHC-Ⅰ类相关蛋白MR1，故被划分为固有免疫细胞。MAIT细胞有TCR依赖方式和TCR非依赖方式这两种激活方式：TCR依赖方式，即APC通过MR1和抗原复合物结合MAIT细胞表面的TCR，同时CD80、CD40结合CD28和CD40L并激活第二信号使得MAIT细胞被激活；而TCR非依赖方式是病毒或LPS结合APC表面TLRs后激活相关通路，使得APC分泌大量IL-12和IL-18，激活MAIT细胞。活化后的MAIT细胞能分泌TNF、IFN-γ和IL-17，并发挥细胞杀伤作用参与炎症反应。
HBV感染患者的外周血中MAIT细胞数量与正常人相比没有显著性差异，但是其活化标志表达升高，提示MAIT细胞具有抗HBV效应。然而在长期HBV感染患者中MAIT细胞表面PD-1表达水平显著升高，更容易发生程序性细胞死亡，其杀伤功能亦受到影响，同时表达CTLA-4，使MAIT细胞发挥免疫抑制作用。
2)在肝脏定居的固有免疫细胞
肝脏不仅是代谢器官，也是重要的免疫器官。大部分免疫相关的蛋白质由肝细胞产生，同时多种在肝脏定居的免疫细胞(如Kupffer细胞、肝脏固有NK细胞和HSCs)能在肝脏中独立发育。在肝脏定居的固有免疫细胞是肝脏免疫微环境的重要组成部分(图5-2)。肝脏在执行代谢任务时可产生大量中间产物和副产物，这些物质都是潜在的抗原，遇到免疫细胞容易发生炎症反应。所以大部分在肝脏定居的免疫细胞在生理条件下偏向于发挥免疫负性调节、维持免疫平衡的作用。而在肝脏感染及癌症患者肝脏中定居的免疫细胞亦可以通过吞噬、分泌炎性细胞因子、表达炎性分子促进抗病原微生物和肿瘤免疫，保护肝脏细胞免受侵害。
图5-2肝脏免疫微环境
(1)Kupffer细胞：1876年德国解剖学家Karl Wilhelm von Kupffer发现肝脏中有一类特殊形状细胞，该细胞后被命名为Kupffer细胞。Kupffer细胞是在肝脏中定居的巨噬细胞，数量占人体所有组织巨噬细胞的80%~90%。Kupffer细胞在胚胎时期由卵黄囊特异性祖细胞分化而来，之后存在于肝脏中，现在研究认为，人体中的Kupffer细胞来源有肝脏原有Kupffer细胞的复制与髓系单核细胞迁移分化两种。在小鼠中，集落刺激因子-1(colony-stimulating factor-1，CSF-1)参与卵黄囊细胞分化为Kupffer细胞的过程。而在Th2细胞大量存在的抗病原微生物反应中，Kupffer细胞主要依靠肝内自我复制而非外来分化维持数量。Kupffer细胞高表达TLRs、NLRs等PRRs，其结合PAMPs和DAMPs后激活MyD88、TRAF3、炎性小体等下游通路从而发挥炎性作用。
人的Kupffer细胞标志为CD14+HLA-DR+HLA-ABC+CD86+DC-SIGN+，并低表达CD1b、CD40和CD83；而小鼠Kupffer细胞标志为CD68+F4/80+CD11blow 。Kupffer细胞在不同刺激下也可以分化为M1和M2两个亚群。
HBV感染能够活化Kupffer细胞。有研究表明HBsAg在体内和体外能有效刺激Kupffer细胞，尽管其表型没有显著性变化，但是炎性细胞因子的表达上升，从而促进NK细胞CD69与IFN-γ的表达。而在炎症消退期，Kupffer细胞参与组织修复过程，通过SRs清除死亡的肝细胞，避免其进一步发生坏死相关的过程而分泌HMGB1等危险信号加重炎症反应。然而在HBV长期持续感染的过程中，Kupffer细胞分泌IL-10，抑制免疫、促进组织修复的同时帮助HBV逃避免疫监视。所以Kupffer细胞在HBV感染中发挥着复杂的作用，如何在正确的时间干预Kupffer细胞的相关免疫功能对乙型肝炎治疗与监控极其重要。
(2)肝脏定居自然杀伤细胞(liver-resident NK cell，LrNK cell)：NK细胞在19世纪70年代被发现，然而一直没有科学家发现组织定居NK细胞，直到2012年Gordon等在肝脏中偶然发现大量的未成熟NK细胞，这才开启了人们对组织定居NK细胞的认识。LrNK细胞是组织定居NK细胞中重要的组成部分，其来源与常规NK(conventional NK，cNK)细胞有很大区别。造血干细胞(hematopoietic stem cells，HSCs)发育成CLPs，在核因子IL-3(nuclear factor IL-3，NFIL3)的诱导下分化为共同天然淋巴细胞前体(CILPs)，而后在不同的环境中分化为NK前体细胞(NK cell progenitors，NKPs)和共同辅助样天然淋巴细胞前体(CHILPs)。cNK细胞来源于NKPs，而LrNK细胞来源于CHILPs。
在小鼠中，LrNK细胞的特征标志是CD49a，这是cNK细胞所不具有的。然而在人体中，LrNK细胞标志存在争议。在肝实质中的LrNK细胞表达CD49a，低表达CCR6，而肝窦中的LrNK细胞高表达核因子Eomes和CCR6。LrNK细胞在肝病中发挥的免疫学作用具有两面性：相比于cNK细胞，LrNK细胞分泌炎性细胞因子(如IFN-γ、TNF-α 和GM-CSF)的水平更高，促炎能力更强；而LrNK细胞表面高表达TRAIL、NKG2A等分子，从而抑制抗病原微生物特异性的CD8+T淋巴细胞的功能。LrNK细胞在HBV感染中的具体作用仍在研究之中。
(3)肝星状细胞(hepatic stellate cells，HSCs)：HSCs是定居于肝脏中的间叶细胞，具有成纤维细胞和周皮细胞的特点。HSCs常分布于Disse腔中，呈梭形或多边形，表达结蛋白等特征分子。HSCs被认为是参与形成肝纤维化的重要细胞：当受到危险信号或者炎性刺激后，HSCs由静止型变为激活型，细胞内部α平滑肌肌动蛋白(α smooth muscle actin，α-SMA)大量合成，并产生促进增殖、纤维化的蛋白，参与炎症反应和肝纤维化过程。
多种因素可导致HSCs活化。在HBV和HCV感染中，免疫细胞杀伤受感染的肝细胞和上皮细胞释放一系列炎症因子，如CCL2、CCL21、IL-8、IL-17、IL-22等，同时凋亡或坏死的靶细胞释放大量DAMPs，这些因子都能强烈刺激静息状态下的HSCs。细胞外基质的环境改变也能影响HSCs的状态：在肝病进展过程中，当细胞外基质成分由Ⅳ型胶原酶、肝素蛋白多糖和层黏蛋白转变为Ⅰ型胶原酶和Ⅲ型胶原酶时，HSCs内整合素通路被激活。肝脏免疫细胞的变化也可影响HSCs的活化状态：炎性条件下巨噬细胞增多，分泌的半乳糖凝集素3能够激活静息状态的HSCs，同时Th17细胞增多，使局部IL-17水平升高，通过HSCs表面的IL-17R激活STAT通路，促使HSCs发挥炎性作用。
在慢性乙型肝炎患者中，活化的HSCs促进炎症持续存在，在一定程度上抑制HBV的复制。通过TLR-3的刺激，HSCs内干扰素相关基因表达升高，Ⅰ型干扰素表达增多，HBV复制受到抑制。另一方面，HSCs能诱导局部产生较多的Th17细胞，而Th17分泌IL-17促进其活化，形成的正反馈加重肝纤维化病情。活化的HSCs与HBV感染局部的Treg增多、NK细胞抗病毒能力受损有关。在HBV相关肝纤维化和肝癌中，将HSCs作为靶细胞干预来缓解病情是现在肝病学研究的热点方向。
(4)肝窦内皮细胞(liver sinusoidal endothelial cells，LSECs)：LSECs是肝脏非实质细胞的主要细胞群，构成肝窦壁，参与形成缺乏基膜的毛细血管结构。LSECs通过SRs、MRs、FcγRⅡb2发挥胞饮作用，清理血管中有害大分子及小颗粒，是保护肝脏的一道重要的屏障。
LSECs是肝内重要的免疫细胞，通过识别病毒DNA和相关抗原LSECs能快速胞饮病毒颗粒。研究发现，进入肝脏的腺病毒有90%被 LSECs清除。LPS、高密度脂蛋白连接的LPS以及抗原-抗体复合物在肝窦中也能被LSECs清除，从而净化肝脏微环境，避免产生次生炎症反应。现已知LSECs表达TLR-2、TLR-3、TLR-4、TLR-6、TLR-8、TLR-9等TLRs与NLRP1、NLRP3、AIM等炎症小体，在PAMPs刺激下通过上述PRRs激活下游通路，分泌炎性细胞因子发挥天然免疫功能。此外，LSECs具备专职APC表达的各类第二信号分子，如CD80、CD86，可以通过呈递抗原，激活IL-6相关通路，使初始 CD8+T淋巴细胞活化，促进Th0细胞分化为各类Th细胞，增强肝脏微环境中的特异性免疫。LSECs也可以呈递自身抗原、口服抗原，通过B7-H1与PD-L1等分子诱导初始 CD8+T淋巴细胞的耐受，维持肝脏免疫平衡。
在肝病进展过程中，LSECs扮演着重要的角色。在肝脏炎症发展时期，一系列趋化因子诱使单核细胞、中性粒细胞和T淋巴细胞进入肝窦，LSECs通过选择素依赖的过程发生变形，让趋化而来的免疫细胞通过肝窦进入肝脏。而LSECs表达的CXCL1能与中性粒细胞形成的NETs结合，引起微血管凝血，诱导产生门静脉高压。LSECs也参与肝纤维化的形成，DDL4分子被发现是抑制纤维化加重的重要因素。而在慢加急性肝衰竭的进程中，LSECs的功能被严重破坏，导致肝脏屏障严重受损，大量有害物质进入肝脏实质，进一步加剧肝脏损伤。
LSECs能有效清除肝窦中的病毒颗粒，所以推测LSECs在HBV感染进程中有重要的抗病毒作用，具体现象与机制还需要进一步研究。
三、肝内适应性免疫
适应性免疫(adaptive immunity)亦称为获得性免疫(acquired immunity)或特异性免疫(specific immunity)，因个体接触特定抗原而产生，仅针对该特定抗原发生反应。此类免疫主要由可特异性识别抗原的淋巴细胞(即T淋巴细胞和B淋巴细胞)所承担，其特点是个体后天获得，具有特异性(specificity)、多样性(diversity)、记忆性(memory)和耐受性(tolerance)。
通常肝脏可通过Kupffer细胞、肝窦内皮细胞和肝星状细胞清除血流中的病原体，因此，正常情况下肝细胞不会接触到病原体。但嗜肝性病毒如HBV似乎可以打破这种“规律”，因为极少量HBV颗粒就可以导致肝细胞感染，且HBV的核衣壳可以被Kupffer细胞表达的TLR-2识别，但在某些情况下，TLR-2被激活后并不产生Ⅰ型IFN，而是产生IL-10。由此可见，HBV可通过少量的病毒颗粒高效地感染肝细胞，并且能导致Ⅰ型IFN分泌减少和IL-10分泌增加，使肝内的固有免疫防线失守，从而不能有效地清除病毒。
如果肝内固有免疫在清除HBV的过程中存在缺陷，那么这项艰巨的任务似乎要交给肝内适应性免疫。适应性免疫主要是指机体的T淋巴细胞和B淋巴细胞接触抗原刺激后发生的特异性细胞免疫和体液免疫反应。T淋巴细胞识别并结合抗原呈递细胞(antigen presenting cell，APC)呈递的抗原，分化为效应性CD4+T淋巴细胞和CD8+T淋巴细胞，发挥细胞免疫效应。B淋巴细胞受到抗原等刺激后产生并分泌抗体发挥体液免疫效应。T淋巴细胞和B淋巴细胞遇到相同抗原再次入侵后，会启动更快捷、高效的免疫反应。可见，适应性免疫区别于固有免疫主要在于其接受抗原刺激后具有特异性、多样性和记忆性。
T淋巴细胞和B淋巴细胞在免疫系统中的作用有所不同。负责细胞免疫的T淋巴细胞表面表达的T淋巴细胞抗原识别受体(TCRs)，不仅识别APC呈递的抗原肽分子，还要识别与抗原肽结合的MHC分子类型，即T淋巴细胞的双识别，其中CD4+T淋巴细胞识别MHC-Ⅱ类分子-抗原肽复合物，CD8+T淋巴细胞识别MHC-Ⅰ类分子-抗原肽复合物。MHC-Ⅱ类分子的表达谱较MHC-Ⅰ类分子窄，主要表达在专职的APC表面上，如树突状细胞、巨噬细胞和B淋巴细胞等；效应性CD8+T淋巴细胞是细胞毒性T淋巴细胞，主要执行抗病毒感染和杀伤病毒感染靶细胞等功能，而CD4+T淋巴细胞主要通过分泌各种细胞因子执行免疫效应和调控其他免疫细胞的功能。B淋巴细胞可以直接识别可溶性抗原或病原体表面的抗原，在CD4+T淋巴细胞辅助下产生抗体，发挥体液免疫功能。
正常情况下，肝内淋巴细胞的组成与外周血有一定的区别。在外周血中，表达αβ链TCR的T淋巴细胞(αβT淋巴细胞)占绝大多数，B淋巴细胞约占10%、NK细胞占10%~15%，另外还有少量的其他淋巴细胞亚群；而在肝内，αβT淋巴细胞数量较少，B淋巴细胞占5%~10%，NK细胞占20%~30%。此外，在外周血中较少出现的淋巴细胞亚群亦可在肝内富集，如表达γδ链TCR的T淋巴细胞(γδT淋巴细胞)，以及同时表达αβ链TCR和NK细胞表面标志的NKT淋巴细胞等，人肝内淋巴细胞亚群见表5-2，通过适当的标记组合和流式细胞仪的光散射特性可以鉴定亚群和总淋巴细胞。然而，这种肝内和外周血淋巴细胞亚群组成差异的相关生物学机制并未完全阐明。下面就肝内淋巴细胞组成及其发挥的主要作用做简要介绍(图5-3)。
表5-2人肝内淋巴细胞亚群
图5-3肝内淋巴细胞组成及其作用
1.CD4+T淋巴细胞
CD4+T淋巴细胞的TCR识别抗原呈递细胞表面的MHC-Ⅱ类分子-抗原肽复合物，激活后主要通过分泌多种细胞因子而发挥效应。在外周血中，CD4+T淋巴细胞和CD8+T淋巴细胞的比值约为2∶1，在正常肝组织中，这种比例却恰恰相反，为1∶2.5。初始CD4+T淋巴细胞与APC的MHC-Ⅱ分子呈递的抗原有效结合，并在CD28等共刺激分子的作用下，发生活化、增殖，成为效应性CD4+T淋巴细胞。效应性CD4+T淋巴细胞分泌各种细胞因子，发挥相应的生物学效应。根据效应性CD4+T淋巴细胞分泌细胞因子的不同，传统上可将其分为Th1细胞和Th2细胞，但随着近年来研究的不断深入，人们发现一类具有负向免疫调节作用的调节性T淋巴细胞(Treg细胞)，以及Th17和Tfh等细胞亚群。
(1)Th1细胞：Th1细胞主要产生大量的IFN-γ、TNF-α和IL-2，在介导机体清除细胞内病原体方面发挥重要作用。IFN-γ、IL-12是促进Th0细胞向Th1细胞分化的关键因子，IFN-γ具有增加APC呈递抗原并正反馈促进Th1细胞分化的作用，并通过多种机制发挥抗感染作用。TNF-α具有诱导大量细胞因子和趋化因子表达从而激活巨噬细胞和增强炎症反应的效应。IFN-γ和TNF-α对肝细胞损伤和肝脏炎症具有联合促进作用。IL-2又名T淋巴细胞生长因子，是所有T淋巴细胞亚群的生长因子，并可促进活化B淋巴细胞增殖，故为调控免疫应答的重要因子。有研究显示，自身免疫性肝炎患者肝穿刺活检标本中有大量的Th1细胞浸润，Th1细胞产生大量的IFN-γ和TNF-α，导致肝脏炎症损害。体外实验亦证明，IFN-γ和TNF-α参与肝脏的炎症反应、肝细胞损伤。此外，细胞模型证明TNF-α还具有肝细胞毒性损伤作用，TNF-α不仅参与自身免疫性肝炎和酒精肝的病理学改变，还参与肝癌的发病，且TNF-α水平降低后，能够抑制致癌物质诱导的大鼠肝癌的发生。
(2)Th2细胞：Th2细胞主要产生IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13、IL-25等细胞因子，IL-4是诱导Th2细胞分化的关键因子。IL-4能诱导B淋巴细胞产生IgE型抗体，调节免疫球蛋白类型转换，促进T淋巴细胞增殖和正反馈，促进初始T淋巴细胞向Th2细胞分化。Th2细胞在介导机体清除细胞外寄生虫过程中非常关键，也是引起机体哮喘以及其他过敏性疾病的主要细胞。在肝内，Th2细胞是参与血吸虫感染所引起的免疫反应的主要免疫细胞。血吸虫感染可引起强烈的肉芽肿反应，从而导致肝纤维化，早期的肉芽肿形成与Th1细胞有关，但很快转化为Th2细胞。Th2细胞在寄生虫感染的初期起到保护性作用，同样由Th2细胞分泌的细胞因子最终却可导致肝纤维化和门静脉高压。研究发现Th2细胞分泌的细胞因子IL-4和IL-13在寄生虫感染中起到的作用明显不同，前者对生存有利，而后者相反。体外实验发现，IL-13缺陷小鼠在发生寄生虫感染时，肝纤维化发生率显著降低，生存率显著提高；相反，IL-4缺陷小鼠肝细胞损伤和死亡率显著提高。在小鼠体内用可溶性抑制剂阻断IL-13的合成可以有效地阻止寄生虫感染引起的肝纤维化，研究发现IL-13可以诱导成纤维细胞的胶原合成。
(3)调节性T淋巴细胞(Treg细胞)：Treg细胞分为天然Treg(natural Treg，nTreg)细胞和诱导型Treg(inducible Treg，iTreg)细胞。前者组成性高表达CD25(IL-2受体的α链)和转录因子Foxp3，同时表达胸腺来源标志Helios和细胞因子IL-35，而后者不表达IL-35。Treg细胞占正常人外周血CD4+T淋巴细胞总数的5%~10%，是机体最重要的免疫调节细胞。此类细胞具有天然的免疫抑制作用，可抑制CD4+或CD8+T淋巴细胞活化、增殖，并能抑制初始T淋巴细胞和记忆性T淋巴细胞的功能。
Treg细胞在肝内具有抑制免疫反应、炎症和免疫损伤，促进肿瘤生长等功能；这些作用主要通过细胞接触和分泌抑制性细胞因子IL-10和TGF-β1抑制其他T淋巴细胞的增殖和功能来实现。有研究显示，在急性肝炎发病初期，较低的Treg细胞数量有利于特异性细胞免疫反应对病毒的清除，而恢复期Treg细胞数量的增加则有利于抑制炎症反应对肝组织的损伤。慢性乙型肝炎患者外周血Treg细胞频率明显高于急性乙型肝炎患者，肝内Treg细胞频率也显著增加，且外周血Treg细胞频率与病毒载量呈正相关。慢性乙型重型肝炎患者Treg细胞在外周血和肝内的频率都显著降低，免疫组织化学染色显示肝组织中CD8+T淋巴细胞数量也明显升高，表明慢性乙型重型肝炎患者肝脏存在较强的免疫反应，Treg细胞浸润肝脏可能有利于维持肝脏免疫平衡，减少损伤。同时Treg细胞也能促进HBV逃避宿主免疫监视，降低HBV特异性CD8+T淋巴细胞的数量。在乙型肝炎相关肝癌患者中，肿瘤内比肿瘤外有更多的Treg细胞浸润。体外实验显示患者的Treg细胞能显著抑制CD8+T淋巴细胞的各种免疫功能。更重要的是，外周血和肿瘤内的Treg细胞水平不仅与肿瘤分级密切相关，还能预示患者生存期的长短。诱导型调节性T淋巴细胞在抗原诱导下生成，包括以下几种：Tr1细胞，多为CD4+T淋巴细胞在抗原刺激和IL-10诱导下生成，能表达高水平IL-10及中等水平TGF-β、IFN-γ、IL-5等，其中IL-10在免疫负调节中发挥主要作用；Th3细胞，在机体口服低剂量抗原后，可刺激机体产生TGF-β、IL-4、IL-10等细胞因子，进而诱导CD4+Th0细胞分化为Th3细胞，其主要分泌TGF-β，对Th1细胞和Th2细胞均有抑制作用。
(4)Th17细胞：Th17细胞是2005年被发现的一种新型的CD4+T淋巴细胞亚群，其表达的细胞因子、生物学功能、分化过程等不同于Th1、Th2细胞。Th17细胞可分泌IL-17A、IL-17F、IL-6、TNF-α、IL-21和IL-22等细胞因子。由于Th17细胞产生大量的IL-17A，因此绝大多数Th17细胞介导的免疫效应是通过IL-17A完成的，其主要效应是促进炎症反应和加剧免疫损伤，在慢性感染和自身免疫性疾病的发生、发展中起重要作用。研究证明，慢性乙型肝炎患者外周血单个核细胞中Th17细胞的数量显著高于正常对照组，且其比例与ALT水平、病毒载量呈正相关；此外，Th17细胞的比例在慢加急性肝衰竭患者外周血中进一步升高。重要的是，慢性乙型肝炎患者肝脏中有大量Th17细胞浸润，且与肝脏病理分级呈显著正相关，这些发现提示Th17细胞与肝损害有关。体外实验发现Th17细胞的主要效应因子IL-17能激活单核细胞和髓样树突状细胞，并能促进两者分泌大量的促炎性细胞因子，而且在患者血浆中，与Th17细胞相关的细胞因子水平显著升高。此外，Th17细胞分泌的IL-17参与激活HSCs，诱导产生更多的促纤维化细胞因子TGF-β，激活胶原合成，加速上皮间充质化，在慢性肝炎向肝纤维化和肝癌发展的过程中起到推进作用。有研究发现TLR-2受体的激活能增加Th17细胞的活性，加重HBV相关慢加急性肝衰竭患者的病情，提示可以通过抑制TLR-2受体减弱Th17细胞的炎性作用，缓解病情。
(5)滤泡辅助性T淋巴细胞(Tfh细胞)：Tfh细胞表型为CXCR5+ICOS+CD40L+，可分泌IL-21、IL-10、IL-4和低水平IFN-γ，是不同于Th1、Th2、Th17细胞的一类CD4+T淋巴细胞亚群。目前认为，Tfh细胞是促进B淋巴细胞增殖、分化以及免疫球蛋白类别转换，辅助B淋巴细胞产生抗体的关键T淋巴细胞亚群，Tfh细胞作用的主要靶细胞是B2淋巴细胞，也就是通常认为的B淋巴细胞。初始T淋巴细胞在IL-6和IL-21的作用下，发生表型转变，变为CD4+ CXCR5+ ICOShighCD40Lhigh细胞，这类细胞直接与B淋巴细胞接触并分泌IL-21，刺激B淋巴细胞分泌抗体。有研究表明HBV转基因小鼠的肝内可以检测到Tfh细胞，而且频率高于正常对照的野生型小鼠；在慢性乙型肝炎患者的研究中发现，免疫清除期患者Tfh细胞的频率比免疫耐受期和正常对照组的高，而且免疫清除期患者Tfh细胞的频率与ALT水平呈正相关。而HBV能够诱导B淋巴细胞表面的抑制性受体FcRL5的表达，使得Tfh细胞与B淋巴细胞的刺激通路被抑制，从而逃避体液免疫。关于Tfh细胞在肝脏特别是肝病中的作用还有待进一步研究。
2.CD8+T淋巴细胞
CD8+T淋巴细胞是T淋巴细胞的重要亚群，是一类具有杀伤活性的效应细胞，其TCR识别靶细胞，如病毒感染细胞、肿瘤细胞等表面的MHC-Ⅰ类分子-抗原肽复合物后，发挥效应细胞作用清除细胞内病原体特别是病毒，如HBV、HCV。效应性CD8+T淋巴细胞可以通过多种途径清除病毒和杀伤靶细胞，如通过诱导细胞程序性死亡、利用细胞表面的效应分子FasL以及通过穿孔素颗粒酶途径杀伤靶细胞。在正常肝脏、慢性乙型肝炎患者和肝癌患者的肝脏都可检测到CD8+T淋巴细胞；此外，CD8+T淋巴细胞可以通过分泌IFN-γ和TNF-α抑制肝细胞内HBV和HCV的复制。
在急性乙型肝炎早期，CD8+T淋巴细胞作为效应细胞发挥着重要作用，随着HBV被逐渐控制，CD8+T淋巴细胞演变为记忆性T淋巴细胞。急、慢性乙型肝炎患者HBV特异性的CD8+T淋巴细胞的功能特点如图5-4所示。但越来越多的证据显示，CD8+T淋巴细胞在部分早期急性乙型肝炎机体中处于功能迟钝状态，其细胞程序死亡受体1(programmed death-1 receptor，PD-1)的表达可能是导致急性乙型肝炎和HBV转基因小鼠CD8+T淋巴细胞功能抑制的原因。CD8+T淋巴细胞PD-1表达上调对急性乙型肝炎患者不利，延迟上调表达2周还可导致急性HBV感染者发生急性肝衰竭。
图5-4急、慢性乙型肝炎患者HBV特异性T淋巴细胞的功能特点
在急性乙型肝炎患者中，HBV特异性的CD8+T淋巴细胞频率和活化程度高，增殖、杀伤能力和细胞因子分泌能力强，因此能够较好地清除HBV；在慢性乙型肝炎患者中，HBV特异性的CD8+T淋巴细胞出现不同程度的功能耗竭，导致HBV不能被清除，HBV抗原水平、ALT水平和HBV DNA载量呈现不同程度的改变。
HBV特异性的CD8+T淋巴细胞耗竭是慢性乙型肝炎患者的重要特征，如不能分泌IFN-γ、抗原刺激后不能增殖以及细胞毒性功能缺失等。实验表明：将HBV肝内复制的小鼠CD8+T淋巴细胞过继到正常小鼠中后，其增殖能力和功能得到恢复，但是仍然显著弱于正常的CD8+T淋巴细胞，这提示HBV特异性的CD8+T淋巴细胞的耗竭可能改变了其基因和表型，导致功能的不可逆变化。上述结论在慢性乙型肝炎患者中也得到了论证。慢性感染患者中CD8+T淋巴细胞耗竭的机制较为复杂，免疫检查点分子尤其是PD-1高表达于CD8+T淋巴细胞表面是CD8+T淋巴细胞耗竭较为重要的原因，通过免疫检查点抗体干预可能增强慢性肝炎患者中CD8+T淋巴细胞的功能。另外抑制性细胞因子、转录组学变化和PI3K/AKT/mTOR信号通路的改变也可能促进CD8+T淋巴细胞的耗竭。
由于T淋巴细胞的TCR基因在胸腺发育中发生重排，导致TCR存在多样性，这是适应性免疫的基础。在抗HBV免疫中，同样存在能特异性结合HBV蛋白和核酸不同部分的CD8+T淋巴细胞，这就形成了抗HBV特异性CD8+T淋巴细胞的多样性，对于对抗HBV逃避免疫监视极其重要。HBV抗原在微环境中的不同浓度导致了相应特异性CD8+T淋巴细胞的数量差异，如HBcAg多于聚合酶，抗HBcAg的CD8+T淋巴细胞数量偏多。病毒载量不同，呈递抗原的细胞不同：高病毒载量时一般为专职APCs(如DCs)呈递HBV抗原，刺激CD8+T淋巴细胞能力强；而低病毒载量时呈递抗原一般由受感染的肝细胞完成，刺激CD8+T淋巴细胞能力较弱。通过分析不同特异性CD8+T淋巴细胞的数量和能力，体外构建针对不同抗原的特异性CD8+T淋巴细胞用于治疗，从而增强抗HBV免疫；也可以通过分析和筛选出免疫功能强的特异性CD8+T淋巴细胞的抗原，利用这些抗原制备更为高效的乙肝疫苗。
HBV感染微环境中复杂的蛋白分子能影响CD8+T淋巴细胞的活性。最新研究表明膜型CD100在基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)2和MMP9的作用下可以转变为分泌型CD100，通过结合LESCs表面的CD72激活LESCs，从而激活CD8+T淋巴细胞；在慢性乙型肝炎患者中，MMP2和分泌型CD100水平下降，这可能是导致CD8+T淋巴细胞功能低下的一个原因。另外有研究发现IL-21可以激活HBV感染机体中CD8+T淋巴细胞，增强其抗感染效应。
不同类型的CD8+T淋巴细胞在HBV感染机体中发挥的作用存在差异。常规CD8+T淋巴细胞表达接受B7分子刺激的CD28分子，然而CD28-CD8+T淋巴细胞展现出了远强于CD28+CD8+T淋巴细胞的细胞毒性。在慢性乙型肝炎病程中，CD28-CD8+T淋巴细胞可以通过NKG2D共刺激，活化后高表达炎性分子IFN-γ、TNF-α杀伤分子穿孔素、颗粒酶B，对感染HBV的肝细胞具有很高的杀伤效率，同时过高的杀伤能力也使其成为肝脏损伤的原因之一。同样作为高杀伤效率的CXCR5+CD8+T淋巴细胞在有效发挥抗病毒作用的同时不过度活化，避免了肝脏炎症损伤。CXCR5+CD8+T淋巴细胞位于滤泡间区，表达滤泡标志CXCR5+，低表达初始CD8+T淋巴细胞表面CCR7标志，促进B淋巴细胞的抗原呈递。在炎性刺激下CXCR5+CD8+T淋巴细胞可以迁移到各淋巴结和炎症局部，发挥炎性效应。最近有研究证明，CXCL13是趋化CXCR5+CD8+T淋巴细胞，使其发挥抗HBV作用的重要趋化因子，而CXCR5+CD8+T淋巴细胞在发生慢性肝炎的肝脏局部不易受外界抑制性分子影响，不易发生功能耗竭。
3.B淋巴细胞
B淋巴细胞来源于骨髓，分布在脾、淋巴结和各器官局部，主要作用是分泌特异性抗体来中和抗原，并由抗体介导一系列杀伤作用，保护机体免受外来病原微生物的侵害，同时还能呈递抗原，刺激T淋巴细胞活化。2010年以前B淋巴细胞和HBV的关系研究并未得到重视，但随着对抗HBV特异性抗体的深入研究，B淋巴细胞在HBV感染研究中的地位逐渐上升。
抗HBsAg抗体是抗HBV的重要标志蛋白，由B淋巴细胞分泌，但是外周血中高浓度的抗HBsAg抗体会诱导免疫耐受。合理降低分泌此抗体的B淋巴细胞丰度可以有效增强抗HBV免疫。当然B淋巴细胞数量正常的情况下有利于清除病毒，这有赖于B淋巴细胞分化为浆细胞的过程。但是慢性乙型肝炎病程中B淋巴细胞表面表达PD-1、CD22等分子，容易产生活化而诱导细胞死亡，B淋巴细胞无法分化为浆细胞并分泌抗体，这也是所谓的慢性乙型肝炎病程中B淋巴细胞的耗竭现象。针对这一问题，有研究者使用PD-1抗体封闭，阻止B淋巴细胞程序性死亡，并使其表达CD21和CD27，进而分化为浆细胞。此外，B淋巴细胞还具有免疫调节功能。研究发现，人体内存在一类调节性B淋巴细胞，其主要通过分泌IL-10、TGF-β发挥免疫负调节作用，可能在维持肝内免疫平衡中发挥重要作用。
适应性免疫的主要作用是产生有效持久的病原特异性免疫应答，除特异性和多样性外，记忆性也是适应性免疫应答的主要特点。肝脏是血流丰富的免疫器官，每时每刻都有大量的血液携带着毒素、病原体和异物等流经肝脏，同时肝脏还是嗜肝病毒和细菌的理想宿主器官，所以肝脏的适应性免疫在整体上发挥特异的免疫效应显得尤为重要。肝内的不同细胞亚群参与不同的免疫效应，各个细胞亚群的产生和分化、免疫效应的调控等方面还有很多未知因素，因此，未来对肝脏适应性免疫的深入研究将有助于对肝病的诊疗。
四、肝脏独特的免疫耐受微环境
从肠道进入肝脏的血液携带大量食物来源的抗原，它们是来源于自然界的外来抗原，大部分对身体无害。非自身抗原在肝脏中的持续存在被认为是对肝脏产生的免疫反应的一种限制，从而形成对外来抗原的耐受环境。
肝内免疫耐受最早在1969年由Calne发现，他通过实验证明在没有免疫抑制的情况下，被移植的猪肝脏通常不会被与其MHC不匹配的宿主排斥。尽管肝内免疫耐受的机制尚不清楚，但可以合理推测肝内抗原呈递细胞，包括DCs、LSECs和Kupffer细胞，在其中起到关键作用。在不同的肝内抗原呈递细胞作用下，T淋巴细胞往往倾向于向CD4+T淋巴细胞分化。
CD4+T淋巴细胞识别抗原是通过TCR结合MHC-Ⅱ类分子与抗原肽；在没有炎症的情况下，Kupffer细胞、LSECs和DCs充当CD4+T淋巴细胞的抗原呈递细胞。LSECs激活CD4+T淋巴细胞会导致免疫偏离。这种特殊的分化途径是LSECs所独有的，可能与LSECs表达的TGF-β有关。CD8+T淋巴细胞的情况更为复杂，因为所有肝细胞都表达MHC-Ⅰ类分子，因此它们都是潜在的抗原呈递细胞。肝细胞活化的CD8+T淋巴细胞比DC活化的CD8+T淋巴细胞生存时间更短，原因在于肝细胞不能给予足够的IL-2与有效的共刺激分子活化T淋巴细胞，这也被称作T淋巴细胞的忽视性死亡。如果肝细胞有助于CD8+T淋巴细胞对肝抗原的耐受，则肝细胞介导的T淋巴细胞活化最终结果是T淋巴细胞外周缺失。
LSECs能向CD8+T淋巴细胞交叉呈递外源性抗原。LSECs激活的CD8+T淋巴细胞的表型与肝细胞激活的T淋巴细胞非常相似。T淋巴细胞的忽视性死亡可能是肝内抗原呈递激活的CD8+T淋巴细胞耐受的一般机制。尽管DCs有着强大的激活T淋巴细胞的能力，但在某些条件下，肝内DCs也可能有助于耐受。在生理条件下，肝内DCs对T淋巴细胞的激活作用较弱。DCs对T淋巴细胞较弱的激活能力归因于DCs的“不成熟”发育状态，也归因于肝脏局部细胞因子环境(高水平IL-10和低水平IL-12)。然而，肝内DCs向T淋巴细胞的抗原呈递一般发生于炎症局部的淋巴组织中而不是肝脏本身。局部微环境对CD117+造血祖细胞分化为耐受性DCs很重要，例如，肝基质细胞驱动祖细胞分化为IL-10highIL-12low调节性或耐受性DCs，抑制T淋巴细胞增殖，这类耐受性DCs还可以通过分泌M-CSF和肝细胞生长因子诱导活化T淋巴细胞凋亡，抑制实验性自身免疫性肝炎。mDCs通过IL-10依赖机制产生大量IL-10，诱导抗原特异性T淋巴细胞低反应，同时产生Treg细胞和分泌IL-4的Th2细胞。未被刺激的pDCs也能诱导T淋巴细胞耐受。
除了专职的抗原呈递细胞外，肝细胞在一定条件下亦可以作为抗原呈递细胞。由于缺乏足够的共刺激分子，初始CD8+T淋巴细胞与肝细胞上同源抗原的首次接触导致了克隆性缺失的免疫耐受。CD1限制肝细胞与典型NKT淋巴细胞的相互作用，导致具有调节功能的表达IL-10的CD8+T淋巴细胞产生。
肝脏内T淋巴细胞的初次活化可能在通过抑制自身反应T淋巴细胞、建立对肝内抗原的外周耐受中发挥重要作用，这些T淋巴细胞在胸腺分化过程中避免了阴性选择。在病毒感染后不久，通过选择性地激活和去除高亲和力CD8+T淋巴细胞，肝脏可能会处理大多数导致早期急性排斥反应或病毒清除的宿主细胞。在病毒性肝炎病程中，高亲和力T淋巴细胞的外周缺失可能会使低亲和力细胞清除病毒，此过程仍能介导持续的免疫损伤。在上述情况下，耐受是一个涉及T淋巴细胞活化的非被动过程。这种最终走向免疫耐受的机制可能会导致短暂的肝损伤。
肝内免疫是对抗HBV的前线防御系统。PRRs在内源性免疫应答中起关键作用，而激动剂激活PRRs有助于控制HBV复制。然而，HBV感染干扰了PRR介导的肝细胞抗病毒信号转导。例如，HBsAg、HBeAg或HBV预处理肝细胞后，肝细胞TLR诱导的抗病毒能力几乎消除了。IFN-γ的产生以及后续干扰素刺激基因(ISG)、IRF-3、NF-kB和ERK1/2诱导均受到HBV成分的抑制。此外，HBV聚合酶可以干扰IRF-3的激活，抑制肝细胞TLR3介导的IFN-γ诱导作用。HBV可靶向结合TLRs和下游信号，从而减弱抗HBV的内源性免疫应答。
此外，细胞内RIG-I和黑色素瘤分化相关基因5(MDA-5)在HBV感染固有免疫中发挥作用，HBV可以靶向RLR信号，从而减弱固有免疫抗病毒反应。HBx亦可以通过抑制蛋白酶体的活性对抗内源性抗病毒防御。HBV前核心蛋白通过与MxA启动子相互作用下调黏液病毒抗性蛋白A(MxA)的表达。上述研究表明HBV可通过多种机制逃避TLR/RIG-I介导的抗病毒信号通路，从而导致细胞内在免疫耐受。
慢性乙型肝炎患者外周血NK细胞的数量、活化程度和细胞因子的产生明显降低，而IL-10分泌增加，抑制NK细胞功能，从而有助于免疫耐受的产生和促进病毒的持久性感染。阻断IL-10的作用或抗病毒治疗可恢复NK细胞活性和IFN-γ生成。活动性慢性乙型肝炎患者外周血中NKG2A+NK细胞比例较高。在接受抗病毒治疗后HBV DNA载量降低的患者中，NKG2A+NK细胞的百分比降低。阻断NKG2A和HLA-E或QA-1的相互作用可以恢复NK细胞的细胞毒性，并以NK细胞依赖的方式促进病毒清除。
CHB患者mDCs和pDCs的表型和功能均可发生改变，HBV感染者循环中的pDCs数量与病毒载量呈负相关，抗病毒治疗可使循环中的pDCs数量恢复。慢性乙型肝炎患者pDCs的功能，包括产生IFN-α和表达共刺激分子的功能均明显受损。HBV和HBsAg不能有效激活pDCs，而且能抑制TLR-9诱导的IRF7磷酸化，以及IFN-α、TNF-α、IP-10和IL-6等细胞因子的产生。HBV和HBsAg能抑制pDCs诱导的NK细胞功能，间接干扰pDCs与单核细胞的相互作用。HBsAg还可上调细胞因子信号转导抑制因子-1(SOCS-1)的表达和血液树突状细胞抗原-2(BDCA-2)的连接，干扰pDCs功能。此外，HBeAg亦能抑制pDCs的功能。HBV对pDCs的功能抑制可能是HBV持续存在的原因之一，亦是HBV逃避免疫监视的机制之一。慢性乙型肝炎患者mDCs的成熟和功能也受到损害。HBV或HBsAg的存在显著降低了IL-12的产生，减弱共刺激分子的表达，阻碍mDCs的抗原呈递功能和激活T淋巴细胞的能力，而阿德福韦治疗可以恢复mDCs的数量和功能。
HBV持续感染可严重损害CD8+T淋巴细胞的功能，尤其是HBV特异性T淋巴细胞。在CHB感染患者中，CD8+T淋巴细胞的增殖能力和抗病毒能力减弱，其特点是抑制信号表达上调、细胞因子产生量低和T淋巴细胞衰竭。PD-1作为一种共抑制受体，参与对感染(特别是慢性病毒感染)的免疫应答，并通过转导共抑制信号减弱T淋巴细胞的活化。PD-1/PD-L1通路可能参与抑制慢性乙型肝炎患者HBV特异性T淋巴细胞功能。在HBV持续存在过程中，PD-1在外周血单个核细胞和肝内淋巴细胞的表达上调，特别是在HBV特异性CD8+T淋巴细胞，PD-1与其抗原呈递细胞的配体PD-L1相互作用，导致CD8+T淋巴细胞功能抑制和凋亡，被称为“T淋巴细胞衰竭”。此外，阻断PD-1/PD-L1通路可改善HBV特异性T淋巴细胞的功能。其他共抑制分子，如CTLA-4和Tim-3，在HBV特异性CD8+T淋巴细胞中表达上调，这些细胞与病毒载量密切相关，并且在持续HBV感染者的T淋巴细胞衰竭过程中起重要作用。HBV感染时肝脏的免疫抑制环境亦促进T淋巴细胞耐受。CD3+CD25+Foxp3+Treg细胞数、免疫抑制细胞因子IL-10和TGF-水平与HBV复制密切相关。细胞内产生的TGF-β介导病毒特异性CD8+T淋巴细胞的Bim依赖性凋亡，阻断TGF-β的作用可能有助于T淋巴细胞功能的重建。
HBV感染后体液免疫功能也受到损害。HBV感染时，TLR-9在B淋巴细胞内的转录活性下调。在C57ML/6小鼠的实验中发现，HBeAg-Tg小鼠在T淋巴细胞和B淋巴细胞水平均表现出对HBeAg的耐受状态，体内外均未产生抗HBeAg抗体，CTLs反应减弱。
因此，HBV的持续存在诱导了免疫功能低下或免疫耐受，严重影响了HBV的清除。
致谢王福生 徐向升
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