适应性免疫在乙型肝炎重症化中的作用
任红 陈敏
一、适应性免疫的相关概念
适应性免疫(adaptive immunity)，又称获得性免疫(acquired immunity)或特异性免疫(specific immunity)，是指机体经一定的抗原物质刺激后才形成的，并能对该抗原产生特异性识别的高度专一性免疫反应。适应性免疫是机体经后天感染或人工预防接种而获得的抵抗感染的能力。适应性免疫的特点：①特异性(专一性)：由特异性抗原刺激而启动，并且应答产物仅识别和结合该特异性抗原。T淋巴细胞受体(T cell antigen receptor，TCR)和B淋巴细胞受体(B cell antigen receptor，BCR)是适应性免疫应答特异性的分子基础。②免疫记忆性(memory)：机体对特异性抗原产生初次应答后，机体产生抗原特异性记忆性T淋巴细胞或B淋巴细胞，当记忆细胞再次遭遇同一抗原刺激时，可迅速、积极地发挥免疫效应，有效清除入侵的病原体。③正反应和负反应：特异性抗体和(或)致敏淋巴细胞产生的免疫应答为正反应。而在某些情况下，免疫系统对再次抗原刺激不再产生针对该抗原的抗体和(或)致敏淋巴细胞，这种低反应性或无反应性，称为负反应，又称免疫耐受性。④多种细胞参与：针对抗原刺激的应答细胞主要是T淋巴细胞和B淋巴细胞，但在完成适应性免疫的过程中，还需要一些抗原呈递细胞与固有免疫细胞(巨噬细胞、粒细胞等)的参与。⑤个体特征：适应性免疫是机体出生后，经抗原刺激并在非适应性免疫的基础上建立的一种保护个体的功能，这种功能在不同的个体中有质和量的差别。适应性免疫的参与细胞：①抗原呈递细胞(antigen presenting cell，APC)：通常将组成性表达MHC-Ⅱ类分子的细胞称为专职APC，包括树突状细胞(DC)、B淋巴细胞及巨噬细胞(macrophages，M)。T淋巴细胞仅能识别经APC处理后的MHC分子结合的抗原肽。②T淋巴细胞：根据T淋巴细胞抗原受体(TCR)二肽链构成不同，可将T淋巴细胞分为TCR αβT淋巴细胞与TCR γδT淋巴细胞。发挥适应性免疫的主要是TCR αβT淋巴细胞。成熟TCR αβT淋巴细胞是高度不均一的细胞群体，根据其表面标志及功能特点，可分为不同亚群。根据细胞表面CD4和CD8分子表达与否，可分为CD4+T淋巴细胞或CD8+T淋巴细胞；而CD4+T淋巴细胞根据其功能不同可分为多种T淋巴细胞亚群，如Th1、Th2、Tfh、Th17及Treg等类T淋巴细胞。(各种细胞亚型的详细介绍请参照本章第一节 内容。)③B淋巴细胞：B淋巴细胞是负责特异性体液免疫的主要细胞。此外，B淋巴细胞还有抗原呈递及细胞因子分泌功能来调节免疫应答。适应性免疫反应是由多种细胞参与的复杂并精细调节的过程，最终能抵抗抗原而不对正常的宿主组织造成损伤。适应性免疫的调控异常与感染的慢性化或自身免疫性疾病相关(图5-5)。
图5-5适应性免疫反应的基本过程
适应性免疫反应分为四期。潜伏期：包括APC捕获处理抗原、将抗原呈递给Th细胞、Th/Tc/B淋巴细胞的激活阶段。对数期：包括体内大量浆细胞形成、抗体产生、Tc细胞大量激活发挥效应功能的阶段。平台期：抗体的产生与降解速率相近、免疫效应细胞的生成与清除速率相近。下降期：浆细胞逐渐死亡、激活的免疫效应细胞被清除、免疫原已被清除、免疫反应得到控制。
(引自：Parslow T G，et al.Medical Immunology［M］.10th ed.2002.有修改。)
二、适应性免疫反应在抗HBV感染中的作用
研究显示，适应性细胞免疫反应的时相、强度、特异性与感染结局间有明显的相关性。在HBV感染后的最初4~6周，血清及肝脏中的HBV DNA及HBV抗原均不能被检测到。在感染早期缺乏抗原是HBV适应性免疫反应延迟的重要原因。
1.HBV及抗原
HBV是一种小的有包膜的DNA病毒，具有独特的结构与复制方式。它含有一条部分双链的带缺口或部分单链区的环状DNA，通过RNA中间体复制。HBV DNA的长链有四个部分重叠的开放阅读框(ORF)，即S区、C区、P区和X区。S区包括前S1、前S2和S区基因，编码前S1、前S2和S三种外壳蛋白；C区包括前C区，编码HBcAg或HBeAg；P区编码DNA聚合酶；X基因的产物是X蛋白。HBV DNA的短链不含开放阅读框，因此不能编码蛋白质。(HBV及相关蛋白质的内容请参照第三章。)
目前认为，HBV蛋白质中诱导HBV感染清除或肝脏炎症免疫反应的主要是表面抗原(HBsAg)和核心抗原(HBcAg)。而HBeAg可能是作为一种免疫耐受原而促进持续感染。DNA多聚酶参与了衣壳化、负链合成启动、逆转录、降解前基因组及促进复制等作用。HBxAg具有多种功能，包括信号转导、转录激活、DNA修复、蛋白降解抑制等，是体内HBV感染所必需的，并可能与HBV潜在的致癌性相关。尽管目前已鉴定出了不同的HBV亚型，但它们的临床表现并无差异。
HBsAg和HBcAg均是很强的免疫原，具有多个抗原表位，可激活多个克隆的CD4+或CD8+T淋巴细胞。HBsAg无感染性而有抗原性，能刺激机体产生抗-HBs。抗-HBs是中和及保护抗体，对同型感染具有保护作用。HBcAg主要存在于受感染的肝细胞核内，复制后被释放至细胞质中，由细胞质中形成的HBsAg包裹，装配成完整的病毒颗粒后释放入血。对HBcAg的免疫应答与HBV感染清除、肝细胞损伤及肝脏炎症均有密切关系。
2.适应性免疫在成人急性HBV感染清除中的作用(图5-6)
图5-6急性自限性乙型肝炎与慢性乙型肝炎特异性免疫反应规律
急性自限性乙型肝炎患者存在强大的多克隆的HBV特异性CD4+或CD8+T淋巴细胞及B淋巴细胞免疫反应。而慢性乙型肝炎患者的特异性免疫反应微弱或缺失(包括Th细胞、B淋巴细胞或Tc细胞)。
(引自：Chang J J，et al.Immunol Cell Biol，2007，85(1)：16-23.有修改。)
对急性HBV感染的黑猩猩模型的研究显示，在HBV感染早期，即HBV侵入肝内、复制扩增及肝内感染传播阶段，HBV不能诱导肝细胞内的基因表达，包括干扰素刺激基因(IFN-stimulated genes，ISG)。在HBV感染患者中也发现，HBV在感染早期(潜伏期)大量复制而难以被免疫系统所检测。随后肝内发生非溶细胞性抗HBV免疫反应，降低病毒血症，清除大部分病毒，这些特异性免疫反应发生在肝脏炎症出现之前。而在HCV感染早期，多种ISG可被诱导表达。结果提示，HCV急性感染明显与固有免疫系统相关。而HBV急性感染与细胞内固有免疫机制无明显关系，与其复制策略有关，HBV的转录模板保持在细胞核中，而在细胞质内已形成了病毒核壳包裹的病毒复制基因组，从而可避免细胞固有免疫反应。(有关固有免疫在乙型肝炎重症化中的作用请参照本章第二节 。)
在典型的急性HBV感染过程中，HBV DNA最早可在感染的1个月内检测到(PCR方法)，直到感染第6周，HBV DNA载量仍保持相对低的水平(102~104 copies/mL)，随后，HBV DNA载量、HBeAg、HBsAg上升到其峰值水平。HBcAg特异性IgM出现较早。感染后10~15周，血清ALT水平开始升高，显示了T淋巴细胞介导的肝损伤。而此时，血清中或肝脏内大部分HBV DNA发生了清除。90%以上的成人急性感染可发生临床症状的消除，出现HBeAg及HBsAg特异性抗体。尽管发生临床症状的消除，但持续存在的微量HBV DNA可由体液及细胞免疫反应得到很好的控制。
(1)HBV抗原处理及呈递过程：研究显示，参与HBV抗原处理与递呈的细胞包括DC、肝内Kupffer细胞，或肝窦内皮细胞(LSEC)等。
尽管HBV不会有效地感染DC，但在急性HBV感染机体中，当HBV感染肝细胞后，组织内的DC可处理凋亡的病毒感染细胞及碎片，并迁移至局部淋巴结，致敏及激活CTL。同时DC及其他APC可招募炎性细胞入肝，激活NK细胞，刺激T淋巴细胞。在转基因小鼠模型中，APC包括DC的激活可显著抑制HBV复制。但在肝内激活病毒特异性T淋巴细胞反应及细胞毒性效应中，LSEC的抗原呈递更为重要。
Kupffer细胞在肝内发挥吞噬、模式识别及抗原呈递作用。有研究显示，Kupffer细胞在肝组织中可快速摄取HBV颗粒，但似乎不将其降解。Kupffer细胞受HBV刺激后，可分泌大量的促炎性介质，其表达TLR-2、TLR-3、TLR-4及产生IL-12、IL-18，继而能刺激NK细胞产生IFN-γ。同时分泌的IL-6等促炎性细胞因子，可激活STAT-3依赖的急性时相反应并激活MAP激酶，从而控制HBV RNA的转录。
目前，关于Kupffer细胞、DC或LSEC在HBV感染肝脏内APC的作用还需进一步探讨。
(2)HBV感染激活T淋巴细胞反应：病毒特异性CTL与CD4+T淋巴细胞在抗病毒免疫中发挥着关键的调节作用。通过直接杀伤感染细胞或间接产生细胞因子或趋化因子方式参与炎症产生或抑制病毒复制的过程。Th细胞主要受APC呈递内化的可溶性抗原的刺激，而CTL主要被APC处理呈递病毒抗原激活。HBV感染肝细胞呈递病毒抗原的能力较弱。病毒抗原被DC或其他APC处理及呈递后在淋巴组织中致敏激活有效的抗病毒T淋巴细胞反应。相反，如果T淋巴细胞致敏发生在肝内，可能导致T淋巴细胞失活、耐受或凋亡。
CD4+T淋巴细胞：在急性乙型肝炎患者外周血中发现，CD4+T淋巴细胞对HBV的反应较强，与病毒清除相关。HBcAg特异性CD4+T淋巴细胞反应在急性HBV感染的潜伏期内即可被检测到，几乎所有的自限性急性HBV感染患者的外周血中均能检测到针对HBcAg多个抗原肽的强大的CD4+辅助T淋巴细胞反应。当临床症状出现时，HBV特异性CD4+T淋巴细胞仍然存在，但频率已很低。在临床恢复后，HBcAg特异性CD4+T淋巴细胞的比例进一步降低。因此，HBcAg特异性CD4+T淋巴细胞反应可能是有效控制病毒血症所必需的，同时可能与HBV清除有关。除HBcAg特异性CD4+T淋巴细胞外，针对HBV多聚酶及调节性乙型肝炎病毒X(hepatitis B virus X，HBx)蛋白抗原肽的CD4+T淋巴细胞也可能发挥重要作用。直到目前，在自限性HBV感染患者中仅鉴定出了与多聚酶相关的可诱导CD4+T淋巴细胞反应的抗原肽。相反，HBsAg并不能诱导同样强大的CD4+T淋巴细胞反应。然而，低频率的HBsAg特异性T淋巴细胞并不说明HBsAg是一种弱的免疫原，因为注射了疫苗的受体能产生针对HBsAg的强大特异性CD4+T淋巴细胞反应。在HBV感染猩猩模型中，用CD4抗体使猩猩体内CD4+T淋巴细胞免疫缺失后，再接种较少量的HBV(104 GE HBV)即可使HBV持续感染。但如果在HBV接种后6周即HBV感染的高峰期对CD4+T淋巴细胞进行免疫缺失操作，则对感染结果无影响。结果提示，CD4+T淋巴细胞不直接参与清除病毒，其可能通过促进病毒特异性B淋巴细胞或CD8+T淋巴细胞反应间接控制HBV感染。感染早期CD4+T淋巴细胞激活是决定感染后期淋巴细胞对HBV应答质与量的关键因素，从而决定了HBV感染的结局。在动物实验中，动物经高剂量HBV接种后，在可检测病毒血症及抗原血症之前就观察到CD4+T淋巴细胞激活。可能是由非传染性的大量大分子抗原启动了CD4+T淋巴细胞激活。早期HBV特异性CD4+T淋巴细胞激活可产生Th1型细胞因子IFN-γ和TNF，是调节APC、诱导有效的抗病毒CTL及T淋巴细胞依赖性B淋巴细胞反应所必需的。相反，若早期CD4+T淋巴细胞反应低下，CD8+T淋巴细胞激活可发生在肝内，最终导致T淋巴细胞失活、耐受或凋亡。
CD8+T淋巴细胞：在急性感染HBV猩猩模型中，外周血病毒特异性CTL可在感染2~3周被检测到，但肝内的CTL在感染2~3个月后才能被检测到。原因可能是肝细胞表面的MHC-Ⅰ表达较低，仅在炎症反应过程中MHC-Ⅰ表达增高。且研究者在此动物模型中发现，CD8+T淋巴细胞是急性HBV感染病程中病毒清除及疾病病理的主要效应细胞。在HBV感染猩猩模型中还发现，HBV基因清除与CD3、CD8、IFN-γ mRNA及IFN-γ基因的表达上调相关，且以一种非溶细胞的机制来清除病毒及部分cccDNA。在一些T淋巴细胞过继输入HBV转基因小鼠或猩猩的实验中，CD8+T淋巴细胞承担了两重功能：其一，通过细胞杀伤功能清除HBV感染肝细胞；其二，通过分泌抗病毒细胞因子(如IFN及TNF-α)介导一种非溶肝细胞性抗病毒机制来阻止肝内HBV基因的表达及复制。CD8+T淋巴细胞的溶细胞及非溶细胞机制清除HBV在HBV感染清除中均起重要作用。
对急性HBV感染患者的研究表明，针对多种病毒抗原的强大CD8+T淋巴细胞反应的发生与HBV感染的清除直接相关。现已鉴定出多种针对HBcAg、HBsAg、HBV多聚酶及HBx抗原肽的细胞毒性CD8+T淋巴细胞。这些CD8+T淋巴细胞可在急性感染恢复后持续存在，或在慢性感染自然恢复后存在。慢性感染及进展性肝损害与弱的寡克隆的CD8+T淋巴细胞反应有关。
滤泡辅助性T淋巴细胞(Tfh细胞)：位于生发中心的一种特殊类型的辅助性T淋巴细胞，通过协助B淋巴细胞的分化在体液免疫应答过程中发挥关键作用。在小鼠模型中发现，针对HBsAg的Tfh细胞反应对于HBV的清除是必需的。
B淋巴细胞：HBV特异性抗体是HBV感染过程中某一阶段的标志物。在急性乙型肝炎恢复期或注射HBV疫苗后出现的HBsAb，作为中和抗体能抑制病毒的黏附与入侵。HBsAb的出现已足以完全预防HBV感染，并代表疾病的消除。如患者从急性感染中恢复，中和HBsAb可提供长期的保护性免疫。
对HBV外膜抗原的抗体反应是T淋巴细胞依赖的过程。在HBV已清除或急性肝炎恢复期患者中，可明显检测到HBsAb，但在慢性HBV感染患者中，HBsAb通常不能被检测到。因此，HBsAb被认为是清除游离HBV颗粒，以及阻止HBV被肝细胞黏附及摄取的关键因素。但是，中和抗体的出现发生在HBV感染后相对较晚的阶段，因此在急性HBV感染患者中，中和抗体可能不参与早期时相的HBV清除。相反，中和抗体可出现在HBV感染清除后，阻止病毒从少量仍然存在HBV感染的细胞内扩散。
3.适应性免疫在慢性HBV感染患者中的特点(图5-5)
(1)慢性HBV感染患者中的APC：有报道显示，HBV可通过干扰DC的功能促进感染的持续存在。但一些研究也显示，在HBV感染患者中并未检测到DC功能损伤。在慢性HBV感染患者中分离出的mDC及pDC中IL-10的表达上调，而IL-12及IFN-α的产生受到抑制。有研究报道，慢性HBV感染患者pDC TLR-9表达降低与IFN-α产生有关。HBsAg接触可能引起DC功能的损伤。
(2)慢性HBV感染患者中的T淋巴细胞：尽管越来越多的证据显示固有免疫反应损伤有助于感染的慢性化，但慢性HBV感染的标志是缺乏强大的HBV特异性的CD8+T淋巴细胞及CD4+T淋巴细胞。
CD4+T淋巴细胞是大量细胞因子的产生者，是交叉激活CD8+T淋巴细胞及T淋巴细胞依赖性抗原诱导B淋巴细胞反应所必需的。在慢性HBV感染与HBV感染恢复者之间CD4+T淋巴细胞反应有明显的差异。慢性感染者的CD4+T淋巴细胞反应弱甚至不能被检测到。由于循环的HBV特异性CD4+T淋巴细胞频率低，因此有关其在HBV感染自然进程中的分化、成熟及功能的报道很少。
HBV特异性的CD8+T淋巴细胞反应在病毒清除及肝脏病理生理过程中起重要作用。在急性自限性HBV感染患者的外周血中，能很容易地检测到强大的、多克隆、多特异性的CD8+T淋巴细胞反应，最终HBV被清除。而在慢性HBV感染患者外周血中，T淋巴细胞反应较弱、短暂、寡特异性或很难被检测到，这些患者的肝脏内存在病毒特异性的T淋巴细胞与疾病的病理有关，而由于功能与数量的关系，这些T淋巴细胞不能清除HBV。而且HBV特异性CD8+T淋巴细胞的功能对HBV复制的控制比数量更重要。有研究显示，慢性HBV感染者的CD8+T淋巴细胞中凋亡相关基因表达上调，其中上调最高的蛋白是Bcl-2作用蛋白(Bim蛋白)。这可能与持续的抗原刺激、反应细胞的激活状态、T淋巴细胞受体激活可诱导效应CD8+T淋巴细胞Bim蛋白的表达有关。另外，肝内HBV抗原呈递或交叉呈递缺陷也可导致HBV特异性CD8+T淋巴细胞Bim蛋白水平的上调。除了病毒特异性的CD8+T淋巴细胞反应耗竭外，慢性HBV感染患者的非抗原特异性CD8+T淋巴细胞功能也存在异常。在高病毒载量及肝脏炎症的患者中，可观察到大量的非病毒特异性CD8+T淋巴细胞汇集入肝，而在无肝脏炎症的患者中未观察到此现象。这些细胞是肝内浸润淋巴细胞的重要组成部分，但目前这些细胞的具体功能并不清楚。慢性乙型肝炎(chronichepatitis B，CHB)患者外周血或肝内CD8+T淋巴细胞IL-2分泌或增殖功能较弱，但有保持产生IFN-γ及TNF-α的能力。肝内T淋巴细胞IL-2产生缺失可阻止HBV特异性CD8+T淋巴细胞的增殖，同时使这些细胞倾向于通过IL-2依赖的Bim途径发生凋亡。另外，尽管持续产生的促炎性细胞因子TNF-α及IFN-γ对非溶细胞性HBV清除过程很重要，但过量时将产生肝脏免疫病理反应。因为IFN-γ可介导肝细胞产生及分泌趋化因子(CXCL9、CXCL10)，其可吸引非抗原特异性细胞的肝内浸润，包括NK细胞等非特异性细胞(可通过TRAIL介导肝细胞凋亡)及非抗原特异性的CD8+T淋巴细胞(可介导肝脏炎症及病毒控制失活)。在HLA-A2阳性携带者，HBcAg 18-27肽被认为是CD8+T淋巴细胞的免疫优势肽。但在病毒载量大于107 copies/mL的慢性感染患者中，这一反应不能被检测到，而HBsAg及多聚酶特异性的CD8+T淋巴细胞反应可以被检测到(提示这些细胞缺乏抗病毒功能)。同时，在慢性感染患者中，HBcAg 18-27肽的氨基酸突变被认为可导致相应CD8+T淋巴细胞的功能缺失，而HBsAg及多聚酶肽却很少发生突变。提示相比于其他CD8+T淋巴细胞，HBcAg 特异性的CD8+T淋巴细胞会承受更大的选择压力。
滤泡辅助性T淋巴细胞(Tfh细胞)：在慢性HBV感染患者或小鼠模型中，针对HBsAg的Tfh细胞反应受到Treg的抑制，Tfh细胞功能减弱，辅助HBV特异性B淋巴细胞的能力降低，而与HBsAg的特异性抗体产生异常相关。
(3)慢性HBV感染中HBV特异性T淋巴细胞反应崩溃的机制：在病毒持续感染机体的过程中，T淋巴细胞与抗原持续相遇，这种对T淋巴细胞的持续刺激可导致T淋巴细胞耗竭，而使抗原特异性T淋巴细胞或B淋巴细胞长时间处于缺失或耐受状态，即在抗原刺激下失去了扩增能力及细胞毒活性。T淋巴细胞耗竭由多种调节机制所介导，包括高水平的抗原暴露、抑制性受体的表达及免疫抑制细胞因子(如IL-10及TGF-β)的出现。此外，HBV特异性T淋巴细胞反应崩溃还可能直接被HBV蛋白的免疫抑制效应及损伤的APC引起。研究表明，慢性HBV感染患者HBV特异性T淋巴细胞内促凋亡基因表达上调，特别是Bcl-2凋亡蛋白作用因子(Bim)明显上调，介导了CD127低表达的HBV特异性CD8+T淋巴细胞凋亡。
同时，在慢性病毒感染机体中T淋巴细胞抑制受体(如PD-1、Tim-3、CTLA-4及LAG-3)的持续表达似乎与慢性病毒感染相关。PD-1是最显著的抑制受体，PD-1可介导T淋巴细胞耗竭，而阻断PD-1的表达可导致细胞因子的产生及CD8+T淋巴细胞数量的增多。
(4)特异性免疫细胞在HBV感染耐受中的机制：HBV的新生儿耐受可能是由母婴传播所致，其可由HBeAg介导。但成人对HBV感染耐受的机制还不十分清楚。多种因素可导致B淋巴细胞及T淋巴细胞抗原表位的失活，及病毒蛋白对特异性免疫的特异性抑制。例如，在成人T淋巴细胞受体的转基因小鼠中，HBeAg可抑制对HBcAg的抗体或T淋巴细胞应答。因此HBeAg可抑制HBcAg特异性T淋巴细胞对感染细胞的免疫清除。因此，在慢性病毒感染成人患者中常常可观察到病毒突变妨碍了HBeAg的产生而与肝脏严重疾病相关。HBsAg可作为高剂量耐受原而抑制免疫清除应答。慢性HBV感染患者显示了低下或无HBsAg特异性CD8+T淋巴细胞活性。HBx、转录反式激活因子，对感染启动有作用，其过量表达可抑制细胞的蛋白酶体的活性，从而干扰抗原处理与呈递。病毒的感染量与HBV免疫耐受也有关系。
(5)Treg在慢性HBV感染中的作用：近年来越来越多的证据显示了Treg在慢性HBV感染中的作用。Treg是CD4+或CD8+T淋巴细胞中的一群极度变化的细胞亚群。Treg可通过直接的细胞与细胞接触或分泌免疫抑制性细胞因子(以一种抗原非特异性的模式)下调抗原特异性的免疫反应。但对于Treg在HBV相关病理过程中的作用，目前一些研究结果还存在差异。一些研究结果显示，慢性HBV感染患者循环中的Treg频率增加或与病毒载量相关，而另一些研究并未发现有此联系。Treg在控制针对肝细胞的免疫反应中具有重要作用。其可通过分泌细胞因子TGF-β或IL-10等限制对肝脏的损害。
(6)B淋巴细胞在慢性HBV感染中的作用：目前已能较好地解释T淋巴细胞在HBV感染控制或HBV慢性感染中的作用，但相比之下，人们对慢性HBV感染中B淋巴细胞的体液免疫反应却知之甚少。
在慢性HBV感染患者中，血清中HBsAb不能被检测到。但每年慢性感染的非活动性乙型肝炎患者有0.5％~0.8％可自行清除HBsAg。与HBsAb不同，HBcAb不具有保护性，在感染的早期阶段即可被检测到，并可出现在几乎所有患者中。HBeAb出现在感染的晚期阶段，并提示感染预后良好。在急性肝炎患者中，临床痊愈与血清HBeAg消失、HBeAb血清间的转换存在相关性。在慢性进展性肝炎患者中，血清HBeAg清除与HBeAb出现标志着从高复制向低复制非活动性肝炎的转化。10％~20％慢性HBV感染者将在HBeAb血清转化后保持高复制的阶段，这主要是由HBV突变而导致的。
三、适应性免疫在乙型肝炎肝脏免疫病理中的作用
HBV是一种非溶细胞性病毒，机体对HBV的免疫反应介导了肝脏免疫病理及肝损害。目前，CTL反应被认为是在HBV感染过程中肝病的免疫发病机理的重要影响因素。首先，肝损害开始出现的时间与HBV特异性CD8+T淋巴细胞富集到肝脏的时间一致。如使CTL缺失，可延缓生物化学、组织学改变及临床肝炎症状的发生。在一些急性或慢性HBV感染患者中，也同样观察到了这种现象。在一些急性自限性乙型肝炎患者中，常常发生相对较重的肝细胞损伤，并伴随着强大的多特异性多克隆的CTL反应。而在慢性迁移性乙型肝炎患者中，CTL反应非常弱，且为寡克隆，甚至由于病毒的突变逃逸而不能识别感染肝细胞。再者，在转基因小鼠实验中，将HBsAg特异性的CD8+T淋巴细胞过继输入免疫耐受的HBV转基因小鼠肝脏内，可产生肝细胞坏死与炎症，导致急性坏死性肝病的发生，这与人的急性病毒性肝炎组织学改变类似。因此，CTL反应可导致病毒性肝炎，CTL对感染肝细胞的细胞毒杀伤作用是肝损害的关键因素(图5-7)。
图5-7CTL杀伤HBV感染肝细胞机制
激活的CTL分泌TNF-α或IFN-γ等细胞因子，诱导肝细胞凋亡或坏死；CTL表达FasL与受HBV感染的肝细胞表面的CD95(Fas)结合，可激活Caspase 途径，进而诱导肝细胞凋亡；CTL分泌颗粒酶B使肝细胞凋亡；CTL分泌穿孔素使肝细胞坏死。
(引自：Chisari F V，et al.Pathol Biol(Paris)，2010，58(4)：258-266.有修改。)
另外，在成功控制HBV复制的患者肝脏中也可发现激活的HBV特异性CD8+T淋巴细胞，说明还有其他机制参与。有报道显示，在有或无肝脏炎症的患者肝内，HBV特异性CD8+T淋巴细胞的频率并无显著性差异。但在有肝脏炎症的患者肝内可发现大量的非抗原特异性的淋巴细胞浸润，而在无肝脏炎症的肝内，并无此发现。在HBV转基因小鼠实验中发现，肝脏内肝细胞或非实质细胞表达的IFN-γ、CXCL9/CXCL10可吸引淋巴细胞入肝；并且过继输入病毒特异性CD8+T淋巴细胞可通过诱导GR1+细胞(中性粒细胞、M、浆细胞样DC)内基质金属蛋白酶来进一步增强招募非抗原特异性GR1-细胞(NK/NKT/B/T淋巴细胞、M、DC)进入肝脏。如果阻断趋化因子或使GR1细胞缺失可减少GR1细胞入肝，降低肝病的严重程度，而不影响病毒的非溶细胞性清除。
因此，激活的病毒特异性CTL除活化了穿孔素与Fas等途径直接介导肝细胞死亡外，还可在肝内产生细胞因子或趋化因子，可招募大量的抗原非特异性的炎性细胞入肝脏，抗原非特异性的炎性细胞介导肝损害并在局部产生促炎性细胞因子，及细胞毒性中介物(TNF-α、穿孔素等)，进一步增强了CTL启动的肝损害。
HBeAg阴性的CHB患者易于复发或发生自发性的肝脏炎症复燃，特点是反复发生大面积的肝脏炎症。纵向的分析显示，肝脏炎症复燃与NK细胞表达TRAIL波动在时间上相关。同时还分析了在肝脏炎症慢性复燃中及复燃后不同时间点的循环细胞因子，结果显示IFN-α及IL-8在慢性复燃时有较大的波动。
肝损害是特异性及非特异性免疫反应共同作用的结果。HBV感染肝细胞在此肝脏环境下抵抗由穿孔素/颗粒酶途径介导的细胞溶解作用，因此，通过TNF超家族的受体介导的细胞死亡可能在肝损害中更重要。其中一个途径是表达于浸润淋巴细胞表面的TRAIL与肝细胞表面的TRAIL死亡诱导受体作用而介导细胞死亡。
四、适应性免疫在慢性乙型肝炎重症化中的作用(图5-8)
图5-8适应性免疫在慢性乙型肝炎重症化中的作用
在慢性乙型肝炎病程中，由于HBV复制突然增加或其他因素诱发体内炎性细胞因子水平急剧升高，肝内T淋巴细胞或B淋巴细胞大量浸润，进而分泌产生大量炎性细胞因子与趋化因子，进一步招募多种免疫活性细胞入肝，导致肝细胞大量凋亡或坏死，最终导致乙型重型肝炎的发生。
(引自：Bertoletti A，et al.Antivir Ther，2010，15(Suppl 3)：15-24.有修改。)
1.T淋巴细胞在乙型肝炎重症化中的作用
(1)T淋巴细胞分泌的炎性细胞因子与乙型肝炎重症化。
有证据显示，系统性免疫反应激活所致的炎性细胞因子潮及脓毒血症样免疫麻痹是乙型重型肝炎的重要特征，即在乙型重型肝炎中促炎与抗炎系统的同时存在，最终导致肝细胞死亡、器官衰竭及免疫失调。肝内富集的T淋巴细胞是炎性细胞因子的重要来源。而TNF-α在乙型重型肝炎的病理发生过程中起到了重要作用。在暴发性肝炎小鼠模型中，肝内非抗原特异性炎性细胞产生的TNF-α在致死性坏死性肝病的发生中起到了关键作用。研究显示，暴发性乙型肝炎及HBV相关慢加急性肝衰竭(HBV-ACLF)患者肝内高表达IL-12、IFN-γ、IL-10等细胞因子。同时报道显示，ACLF患者肝内出现促炎性细胞因子与抗炎性细胞因子的平衡紊乱，即在ACLF患者肝内促炎性细胞因子IFN-γ、TNF-α的表达明显强于CHB患者及正常对照者。但在ACLF及CHB患者中，抗炎性细胞因子IL-10表达相近。IFN-γ的高表达与增加的CD4+及CD8+T淋巴细胞聚集显著相关。而TNF-α上调可能与Kupffer细胞等增加相关。
CHB向重型肝炎发展的过程中，不仅T淋巴细胞反应可导致肝脏免疫病理反应，除此之外，激活的CTL在肝内产生大量的细胞因子(IFN-γ)或趋化因子(CXCL9、CXCL10等)，可招募大量的抗原非特异性的炎性细胞入肝脏，增强了CTL启动的肝损害，可使肝细胞大量死亡。
(2)CD4+T淋巴细胞与乙型肝炎重症化。
有关CD4+ T淋巴细胞在乙型肝炎重症化中的作用研究，主要集中在Treg与Th17上。研究表明，ACLF患者外周血中CD4+CD25highTreg比例较HD及CHB患者显著升高，并与HBV DNA载量呈正相关。也有研究表明，ACLF患者与脓毒症休克患者相类似，外周血CD4+T淋巴细胞计数降低，但CD4+Treg数量无显著变化，而常规T淋巴细胞(Tconv)计数降低，Treg/Tconv值增加，Treg-Ⅱ及Treg-Ⅲ的比例升高。研究还发现，ACLF患者除外周血Treg显著增加外，肝内Foxp3+细胞比例也显著增高，且CD4+CD45RA-Foxp3hi-activated Tregs(aTregs)的比例选择性升高。Foxp3+细胞主要定位于汇管区，高比例的Treg与ACLF患者严重的肝病状态相关，并与疾病短期预后不良有关。同时Yang等还检测了CD4+CD25+Tregs细胞TCR BV CDR3区的分子谱，发现ACLF患者的TCRBV11、BV13.1、BV18、BV20表达较高。且CD4+CD25highTreg比例指示了疾病严重程度，相对保守的TCRBV20 CDR3区段“TGTGHSPLH”和TCRBV11 CDR3 区“VYNEQ”可能有助于ACLF的诊断和治疗。Jin等人发现，ACLF患者的CD4+T淋巴细胞与CHB患者间存在多个组蛋白H3赖氨酸9(H3K9)乙酰化基因上的差异，这些基因与内质网应急通路相关，可能与疾病相关。
在有关Th17与乙型重型肝炎的研究中发现，ACLF患者分泌IL-17A的CD45RA-Foxp3low非抑制型T淋巴细胞(non-Tregs)比例显著升高，并与肝脏损伤相关。ACLF患者循环中Th17增多，肝内Th17的占比高于外周血，Th17中的IL-23R上调，IL-23R与Th17、炎症、疾病严重程度相关。同时ACLF患者PBMC内RORα及RORγt mRNA高表达，HBV、RORγt、IL-6与IL-23与Th17比例呈正相关，RORγt mRNA水平与MELD评分呈正相关，并可能与疾病的严重程度相关。还有一些研究探讨了Th17活性增高的机制，发现TLR2信号在Th17分化和HBV-ACLF的疾病加重中可能起到关键作用。同时HBV-ACLF患者IL-6产生增加，并可通过mTOR/STAT3通路增强Th17的免疫反应。
也有研究显示了其他Th亚型与乙型重型肝炎的相关性，如发现Th22亚型在HBV-ACLF患者外周血中比例上调，血浆IL-22水平升高，升高的Th22及IL-22水平与疾病严重程度相关。
(3)CD8+T淋巴细胞与HBV-ACLF。
目前有关CD8+T淋巴细胞在乙型重型肝炎中作用的研究较少。现有的研究显示，活化的CD8+T淋巴细胞比例降低与重型肝炎患者不良预后有关。慢性乙型肝炎患者perforin+和TCM(CD45RA-CD62LhiCCR7+)CD8+T比例较高，ACLF患者CD38+CD8+T淋巴细胞比例较低。
2.T淋巴细胞的免疫平衡紊乱在乙型肝炎重症化中的作用
(1)Th17与Treg的平衡紊乱：报道显示，从CHB到ACLF，随着疾病程度的不断加剧，Th17在外周血中的比例也增加，且在CHB患者的肝组织内，发现了大量Th17的聚集。循环及肝内Th17的增加与血清HBV DNA载量、转氨酶水平及组织活动指数呈正相关，且血清中Th17相关的细胞因子在CHB或ACLF患者中亦增高。
同时，有研究表明，ACLF患者外周血中的Th17与Foxp3+Treg的比例均升高，Th17/Treg值与ACLF患者的生存率呈负相关，且Treg不能调节CD4+T淋巴细胞IL-17的分泌，但可明显抑制IFN-γ的产生。
(2)T淋巴细胞与单核细胞的平衡紊乱：有研究显示，ACLF患者的外周血中，由于CD3+T淋巴细胞比例降低而单核细胞(M)比例升高，使T/M值降低。T/M值在ACLF早期及过渡期降低，在终末期降至最低。并且，T/M值与终末期肝病模型(model for end-stage liver disease，MELD)评分系统的得分、直接胆红素，或血清TNF-α水平呈负相关。结果提示，在ACLF病程中，T淋巴细胞可能抑制单核细胞分泌炎性细胞因子而负调控单核细胞的功能。
3.T淋巴细胞诱导肝细胞凋亡在乙型肝炎重症化中的作用
在乙型重型肝炎患者中，肝细胞坏死与凋亡同时存在，在暴发性肝衰竭及ACLF患者的肝小叶内发现了大量凋亡肝细胞，并与肝小叶损伤程度相关。Bax与Fas表达于未损伤的肝细胞，而Bcl-2表达于浸润的淋巴细胞。凋亡的肝细胞与Bax表达及炎性细胞浸润分级显著相关。结果显示凋亡在大量及亚大量肝细胞死亡中发挥了重要的作用，且Bax可能比Fas或Bcl-2更为重要。在暴发性肝衰竭患者中，亦可观察到肝细胞Fas的强阳性表达，肝脏炎性浸润淋巴细胞、外周淋巴细胞上FasL及血清可溶性FasL水平上调，使Fas途径活化，诱导肝细胞凋亡。
正常肝细胞中TNF-R1 的表达水平很低，但在各种急、慢性肝病中，TNF-R1在肝实质细胞、肝窦内皮细胞和炎性浸润细胞中大量表达。因此，肝细胞也可通过TNF-R途径诱导细胞凋亡。
4.B淋巴细胞在乙型肝炎重症化中的作用
Farci等人用基因芯片比较了HBV相关急性重型肝炎患者与正常对照者肝组织的基因表达谱，发现与免疫反应相关的基因变化明显，其中基因表达上调最显著的是与B淋巴细胞基因信号相关的基因。在这些基因中，免疫球蛋白家族基因表达非常明显，包括κ与λ轻链分布，表明肝组织中为多克隆B淋巴细胞群。其次还包括B淋巴细胞的表面受体，B淋巴细胞发育的转录调节子等均呈不同程度的表达增强。报道还显示，HBV相关急性重型肝炎患者的肝内聚集了大量的分泌IgG和IgM的浆细胞，并伴随着补体的沉积。同时实验证实，这些抗体是针对HBcAg的，并显示限制性的可变重链区的基因谱型并缺乏体细胞突变。
Yan等人检测了HBV-ACLF患者PBMC中B淋巴细胞免疫球蛋白重链谱，其BCR CDR3恒定区、可变区及连接区的分布与健康对照者相近，但克隆扩增度高于对照者，并可能与HBV-ACLF相关。
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