固有免疫在乙型肝炎重症化中的作用
宁琴 陈韬
肝脏是人体最大的实质性器官，有双重的血液供应，80%的血液来自门静脉，收集来自胃肠道富含细菌和毒素的血液，其余20%来自肝动脉。肝脏细胞总数的70%为肝细胞，其余的细胞由非实质细胞组成，包括肝窦内皮细胞(LSEC)、肝星状细胞(hepatic stellate cell，HSC)、Kupffer细胞(KC)和肝脏单个核细胞(liver monocyte cell，LMC)等。肝组织不仅是重要的代谢器官，同时也是重要的免疫器官。肝脏涉及固有免疫的功能有合成急性期反应蛋白(acute phase protein，APP)、非特异性吞噬功能、非特异性细胞杀伤及有害分子代谢等。既往有关肝病的免疫研究主要集中在适应性免疫上，实际上机体抵抗病毒、细菌等病原体的感染及肿瘤的形成依赖于一整套防御系统，既需固有免疫参与，又需适应性免疫参与，任一方面的免疫应答缺陷，都可能导致疾病的发生和发展。肝脏具有自己独特的固有免疫和适应性免疫反应的细胞群体，包括Kupffer细胞、肝窦内皮细胞(LSEC)、树突状细胞(DC)、NK细胞、NKT淋巴细胞、髓源性抑制细胞(myeloid-derived suppressor cells，MDSCs)及适应性T淋巴细胞和B淋巴细胞、细胞因子(cytokine，CK)、补体(complement)、急性期反应蛋白及趋化因子等。肝脏免疫既可以参与炎症反应，亦可以形成免疫耐受，如慢性乙型肝炎患者或者无症状病毒携带者等。
近年来，随着对肝脏免疫功能研究的深入，有学者提出“肝脏是一个固有免疫器官”的概念。肝脏的固有免疫器官功能反映在如下几个方面。首先，从解剖学角度来看，面对来自消化道的大量抗原，包括食物来源的抗原、病原体及毒素，肝脏能够快速地清除这些有害物质。研究显示，肝脏淋巴细胞主要分布于门静脉汇管区，有助于肝脏针对来自消化道的抗原做出迅速反应。其次，80%~90%的自体蛋白由肝脏合成，包括急性期反应蛋白(APP)、补体及可溶性PRRs等天然免疫相关分子。APP是感染后产生固有免疫以及减轻由蛋白酶失活引起组织损伤的关键分子，由病原体及死亡细胞或即将凋亡的细胞所产生。补体系统由超过35种蛋白组成，包括血清蛋白、浆膜蛋白及细胞膜受体。这些蛋白均由肝脏合成，占血清球蛋白总量的5%，通过相互作用抵御感染。另一方面，补体在各种肝病发病中起重要作用。肝脏作为固有免疫器官最重要的依据是，肝脏包含大量的固有免疫细胞，包括吞噬细胞如Kupffer细胞及淋巴细胞。肝脏Kupffer细胞的数量可达定居在人体组织巨噬细胞总量的80%~90%。同时，肝脏富含NK细胞和NKT淋巴细胞。在小鼠肝脏中，NK细胞及NKT淋巴细胞分别占淋巴细胞总数的10%和30%；而在大鼠及人类肝脏中，NK细胞占总淋巴细胞数的30%~50%，NKT淋巴细胞占25%以上，两者总和(2×109～5×109个细胞)已远远超出外周血中NK细胞的总数(不足1×109个细胞)。与之相对的是，其他器官如脾的固有免疫细胞则少得多。鉴于代表固有免疫系统的NK细胞、NKT淋巴细胞和γδT淋巴细胞占总淋巴细胞的2/3左右，且肝脏的Kupffer细胞总量占机体单核-巨噬细胞总数的1/2以上，肝脏可以称为机体最大的专职固有免疫功能的器官。占肝脏总体组织90%的肝细胞及血管内皮细胞还表达多种细胞因子、刺激因子、趋化因子，从而构成了一个十分复杂的网络体系。同时，多项临床试验及动物模型研究也显示，肝脏内几乎所有的固有免疫细胞在介导抗感染过程中，均有可能导致肝损害，从功能上反映出固有免疫系统在肝脏病理、生理方面的重要地位。
一、炎性细胞因子在乙型肝炎重症化中的作用
为了维持机体的生理平衡，抵抗病原微生物的侵袭，防止机体损害的发生，机体的许多细胞，特别是免疫细胞合成和分泌多种微量的多肽类因子，称为细胞因子，包括淋巴细胞产生的淋巴因子、单核细胞产生的单核因子、各种生长因子等。这些细胞因子在细胞之间传递信息，调节细胞的生理过程，提高机体的免疫力，在异常情况下也有可能引起发热、炎症、休克等病理过程。细胞因子亦可根据其功能命名，如白细胞介素(IL)、干扰素(IFN)、集落刺激因子(CSF)、肿瘤坏死因子(TNF)等。
1.分类
细胞因子根据主要功能分为不同类型。
(1)白细胞介素(interleukin，IL)：由淋巴细胞、单核细胞或其他非单个核细胞产生的细胞因子，介导白细胞间相互作用，在免疫调节、造血以及炎症过程中起重要调节作用，凡命名为白细胞介素的细胞因子cDNA基因克隆和表达均已获得成功，目前已报道的有30余种(IL-1～IL-35)。
(2)集落刺激因子(colony stimulating factor，CSF)：根据刺激造血干细胞或分化不同阶段的造血细胞在半固体培养基中形成不同的细胞集落，分别命名为粒细胞集落刺激因子(G-CSF)，巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)，粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)，多重集落刺激因子(multi-CSF)，即IL-3、干细胞集落刺激因子(SCF)，以及红细胞生成素(EPO)等。不同CSF不仅可刺激不同发育阶段的造血干细胞和祖细胞的增殖及分化，还可促进成熟细胞发挥功能。
(3)干扰素(IFN)：最初发现某一种病毒感染细胞能产生一种可干扰另一种病毒感染和复制的物质，因此而得名。根据干扰素产生的来源和结构不同，可分为IFN-α、IFN-β和IFN-γ，它们分别由白细胞、成纤维细胞和活化T淋巴细胞所产生。目前将干扰素分为三型。Ⅰ型：有IFN-α和IFN-β，其中IFN-α有二十种亚型，IFN-β仅有一种亚型。Ⅱ型：只有IFN-γ，且只有一种亚型。Ⅲ型：IFN-λ1(IL-29)、IFN-λ2(IL-28a)、IFN-λ3(IL-28b)。各种不同的IFN生物学活性基本相同，具有抗病毒、抗肿瘤和免疫调节等作用。
(4)肿瘤坏死因子(TNF)：因最初发现这种物质能造成肿瘤组织坏死而得名。根据其产生来源和结构不同，可分为TNF-α和TNF-β两类，前者由单核-巨噬细胞产生，后者由活化T淋巴细胞产生，又名淋巴毒素(lymphotoxin，LT)。两类TNF基本的生物学活性相似，除具有杀伤肿瘤细胞的作用外，还具有免疫调节、参与发热和炎症发生的作用。大剂量TNF-α可引起恶液质，因而TNF-α又称恶液质素(cachectin)。
(5)转化生长因子-β家族(transforming growth factor-β family，TGF-β family)：由多种细胞产生，主要包括TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGF-β1β2以及骨形成蛋白质(bone morphogenetic protein，BMP)等。
(6)生长因子(growth factor，GF)：如表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)、血小板衍生的生长因子(platelet-derived growth factor，PDGF)、成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor，FGF)、肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor，HGF)、胰岛素样生长因子-Ⅰ(IGF-Ⅰ)、IGF-Ⅱ、白血病抑制因子(leukemia inhibitor factor，LIF)、神经生长因子(nerve growth factor，NGF)、抑瘤素M(oncostain M，OSM)、血小板衍生的内皮细胞生长因子(platelet-derived endothelial cell growth factor，PDECGF)、转化生长因子-α(TGF-α)、血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)等。
(7)趋化因子家族(chemokine family)：包括两个亚族。①CXC/α亚族，主要趋化中性粒细胞，主要成员有IL-8、黑素瘤细胞生长刺激因子(GRO/MGSA)、血小板因子-4(PF-4)、血小板碱性蛋白、蛋白质水解来源的产物结缔组织激活蛋白-Ⅲ(CTAP-Ⅲ)和β-血小板球蛋白(β-thromboglobulin)、干扰素诱导蛋白-10(IP-10)、趋化性细胞因子-78(ENA-78)等；②CC/β亚族，主要趋化单核细胞，这个亚族的成员包括巨噬细胞炎性蛋白-1α(MIP-1α)、MIP-1β、RANTES蛋白、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1/MCAF)、MCP-2、MCP-3和I309。
细胞因子形成的相互作用网络在重型肝炎发病机制中具有重要作用，尤其是IFN-γ、TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8及血栓素等。
一些新的与重型肝炎有关的细胞因子被陆续报道。Leifeld等发现IL-12和IFN-γ在乙型暴发性肝炎(fulminanthepatitis B，FHB)患者体内大量诱导，而抗炎细胞因子 IL-10水平未发生变化，无法抗衡 IL-12 和IFN-γ的致炎作用，从而引起肝脏大面积坏死。国内张绪清等报道，细胞间黏附分子-1(ICAM-1)在非肝病和慢性无症状携带者肝细胞中无mRNA表达，而在乙型重型肝炎患者肝细胞中表达明显增强。该领域的研究进展迅速，下面简述细胞因子的功能及其在重型肝炎发生及发展中的作用。
2.细胞因子在乙型肝炎重症化中的作用
(1)IFN-γ：IFN-γ是由多种淋巴细胞和单核细胞产生的重要免疫调节性细胞因子，具有诱导MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ类抗原的表达、诱导TNF-α的产生等多种生物学功能。IFN-γ在Th细胞分化过程中也发挥重要作用，刺激Th0细胞分化为Th1细胞。MHC-Ⅰ类抗原限制性CD8+ CTL介导的免疫效应具有双重作用，在清除病毒的同时也造成了肝细胞损伤。在HBV 转基因动物模型的研究中发现，CTL诱导的肝细胞免疫病理损伤是一有序的多级化过程，其中IFN-γ可以激活肝内巨噬细胞并诱导迟发性超敏反应造成肝损害。Zou等研究发现，与普通慢性乙型肝炎患者及正常对照者相比，慢加急性肝衰竭患者血清中IFN-γ和TNF-α的水平显著上调，此类患者外周血CD4+T淋巴细胞与CD8+IFN-γ+CTL聚集增多，由此可推测它在暴发性肝炎及重型肝炎发病中可能起着一定作用。已有报道，乙型肝炎早期产生的HBV 抗原特异性T淋巴细胞途经肝脏但多数并不在肝脏停留，而是通过产生细胞因子如IFN-γ等，透过肝窦内皮细胞孔隙激发肝内非特异性免疫细胞，激活肝内NK细胞、NKT淋巴细胞分泌大量细胞因子，即免疫放大效应，发挥非溶细胞性清除HBV的作用。但在高病毒复制状态下，HBV特异性T淋巴细胞既可在肝脏停留，也可以在肝内过度激活，释放大量IFN-γ，并进一步激活NK细胞等非特异性免疫细胞，导致肝细胞受损，这可能是重型肝炎肝损害迅速加重的原因之一。有实验观察到，IFN-γ在发挥其抗病毒作用的同时并不一定伴随肝损害，这说明它本身可能并无直接肝损害作用，而有可能是在一定条件下通过激活由死亡受体介导的信号转导系统，间接诱发肝细胞损伤或死亡的。
(2)TNF-α：TNF-α主要由活化的单核-巨噬细胞产生。正常情况下，TNF-α在人体内浓度很低，具有调节免疫应答、促进细胞生长分化等多种功能。研究发现重型肝炎患者血清中 TNF-α水平明显升高，且最终死亡的病例TNF-α水平比存活病例高。目前认为 TNF-α具有双重作用，在损伤早期，高水平的TNF-α可保护肝细胞免于凋亡，有益于肝细胞修复和再生，但随着病情进展，持续的高水平状态又会诱导肝细胞凋亡或坏死。重型肝炎患者常常存在内毒素血症。内毒素的主要成分脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)具有广泛的免疫活性，除对肝细胞有直接毒性外，还能激活单核-巨噬细胞系统，释放多种细胞因子及炎性介质，亦是TNF-α较强的诱导剂。
相对于亚急性暴发性肝炎、急性肝炎和健康志愿者，急性暴发性肝衰竭患者血清中TNF-α水平明显升高，TNF-α的表达水平同暴发性肝衰竭中凋亡的肝细胞数量之间呈显著正相关，因此认为TNF-α在重型肝炎的发病机制中可能通过诱导凋亡而发挥作用。在这一过程中，TNF-α可能通过诱导Fas基因转录或其他信号转导系统而最终导致肝细胞大量凋亡。除诱导凋亡外，TNF-α还可诱导其他细胞因子产生或释放，如IL-6、IL-8等通过级联放大作用促进肝内的炎症反应，加速肝细胞坏死。
TRAIL是新发现的一种与TNF、FasL同属TNF超家族的凋亡诱导分子。体外实验和动物模型中的研究均表明，可溶性TRAIL能诱导正常肝细胞及肝癌细胞凋亡，对肝细胞具有严重的毒性作用，这说明TRAIL在肝细胞凋亡和肝炎的发生中起一定作用。重型肝炎患者血清可溶性TRAIL显著升高，且与血清LPS浓度及肝损害严重程度呈正相关，提示TRAIL诱导的凋亡途径在重型肝炎中也具有重要作用。重型肝炎患者因肝脏受损严重，导致体内LPS降解减少，可能刺激单核-巨噬细胞、DC等表达TRAIL增多，脱落的可溶性 TRAIL也相应增多，与肝细胞上受体结合后引起正常的肝细胞凋亡，从而进一步加重肝损害。
(3)IL：IL由单核-巨噬细胞产生，可通过多个环节参与机体多种免疫反应。IL家族中部分成员是上游调节因子，部分成员是效应细胞因子，部分成员兼具调节因子和效应因子的作用。在暴发性病毒性肝炎及急性肝炎患者中可检测到IL-2、IL-4、IL-6 和IL-8水平升高，IL-6 和IL-8作为效应细胞因子，其水平升高可能直接导致肝细胞受损而参与重型肝炎的发病。IL-2 作为调节因子，可以和TNF-α一起诱导 CTL的细胞毒作用，使得免疫细胞和细胞因子相互作用，从而加重了肝细胞的坏死。另外，其他白细胞介素如IL-1、IL-10、IL-18及IL-15在重型肝炎发病中也可能起一定的作用。IL家族与其他细胞因子相互作用，随着活化的淋巴细胞、单核-巨噬细胞的浸润不断放大，从而形成了复杂的网络。内毒素和CTL产生的IFN均可激活单核-巨噬细胞，单核-巨噬细胞释放多种细胞因子，其中TNF-α、IL-6等直接损伤肝细胞，而IL-1又促使Th1细胞产生IL-2，再激活CTL，从而加重病情，使患者体内蓄积更多的内毒素，形成恶性循环，最终导致重型肝炎。
目前，IL-18在病毒性肝炎发生及发展中的作用受到重视。IL-18由免疫细胞及非免疫细胞产生或释放，具有抗 HBV作用，它在抗HBV过程中既是上游调节因子又是效应细胞因子。IL-18在抗HBV的同时对肝细胞造成一定损伤，可刺激T淋巴细胞增殖，增强T淋巴细胞的细胞毒作用，介导细胞凋亡，另外在肝纤维化中也起一定作用。检测肝移植术后急性重型肝炎患者的 IL-18、TNF-α和可溶性Fas配体(soluble Fas ligand，sFasL)发现，死亡患者IL-18水平明显高于生存患者，认为患者死亡的可能重要原因是IL-18活化了Kupffer细胞，通过提高TNF-α和FasL的表达而发挥作用。
(4)一氧化氮(nitric oxide，NO)：NO是一种半衰期极短的生物调节因子，它通过NO合成酶(NOS)催化L-精氨酸生成。目前研究认为，NO具有潜在的诱导抗病毒活性，而且可能是造成肝损害的介导因子之一。对诱导型NOS(iNOS)缺陷型小鼠模型的研究发现，该小鼠模型由于NO 合成障碍，可耐受CTL在抑制病毒复制过程中可能造成的免疫损伤，也可以对抗致死量的抗Fas抗体注射，使之免于由注射抗Fas抗体而引起的肝坏死，并且无肝损害表现。重型肝炎患者血清中NO水平显著升高，当体内炎症反应逐渐减轻，肝功能好转，病情进入恢复期时NO水平又大幅下降。这些研究均说明 NO与肝内炎症程度、病情严重程度密切相关，在重型肝炎发病中起一定作用。
(5)其他：除上述细胞因子外，还有许多细胞因子参与了重型肝炎的发病。肝细胞生长因子(HGF)、趋化因子、TGF-β1及胰岛素样生长因子(IGF)等在重型肝炎的发病中分别起不同的作用。
HGF是成熟肝细胞DNA合成最强的刺激因子和肝损伤后再生的激发因子。研究发现，HGF也能使小气道上皮细胞免于由TNF-α诱发的细胞凋亡。在重型肝炎患者中，由于肝脏代谢功能大大降低，不能有效地将血液中的HGF清除，加之部分炎症因子浓度升高，刺激肝脏非实质细胞合成HGF，导致血液中HGF含量随病情发展而进行性升高。在肝脏，HGF由肝的非实质细胞(主要是肝星状细胞)产生，通过其受体c-met起作用。近年来研究证实，诱导性急性肝衰竭大鼠肝细胞再生活性缺乏与HGF和HGF受体c-met mRNA延迟表达有关。
趋化因子是一个免疫因子大家族，在生理与病理过程中对白细胞游走起调节作用。趋化因子可以诱导由正常T淋巴细胞分泌的调节因子(RANTES)的表达，活化巨噬细胞与淋巴细胞，构成重型肝炎炎症浸润的重要成分。已经证实，重型肝炎患者血液中化学趋动因子的水平和肝内表达超过正常对照人群和慢性肝病患者。Leifeld等通过化学趋向性实验证实，化学趋动因子在肝内过度释放是重型肝炎发病过程中早期和重要的环节。
TGF-β1是体内广泛存在的一种多功能生长调节因子，主要由活化的肝星状细胞及Kupffer细胞产生，具有调节细胞生长发育和损伤后组织重建等功能。现已证明，在重型肝炎的发病中 TGF-β1对肝细胞再生起抑制作用，并能促进肝细胞凋亡。TGF-β1可能通过调节Cyclin D1、Cyclin E的表达来阻断生长因子信号转导，进而抑制细胞DNA合成。
胰岛素样生长因子(IGF)是一种具有广泛生理作用的生长激素依赖性生长因子，不仅通过典型的内分泌途径作用于靶细胞，还通过自分泌、旁分泌方式参与局部组织细胞的生长调节。重型肝炎患者肝细胞功能严重受损，血清IGF-Ⅰ、IGF-Ⅱ、胰岛素样生长因子结合蛋白-3(insulin-like growth factor binding protein-3，IGFBP-3)水平显著降低可影响重型肝炎患者肝细胞的再生。这一系列的细胞因子并非孤立存在的，而是形成一个独特的细胞因子网络，共同参与肝细胞凋亡与坏死过程。目前认为，TNF-α发挥着核心作用，其他介质则共同发挥着协同、辅助和增强作用。
二、固有免疫细胞在乙型肝炎重症化中的作用
1.NK细胞在乙型肝炎重症化中的作用
(1)NK细胞受体(NKR)：20世纪90年代以来，NKR的发现使NK细胞研究进一步得到人们关注。20世纪70年代和80年代前期Ig重排(BCR)的起源和T淋巴细胞受体(TCR)的多样性均逐渐显露端倪，这使人们基本上认清了机体主要免疫细胞特异性清除抗原的奥秘。自发现NK细胞以来，免疫学家们从未放弃研究NK细胞的分子识别机制，并努力揭开NK细胞广谱识别“自我”与“非我”的奥秘，十分希望能像描述TCR一样描述NKR。近十年来，人们已基本描绘出NKR轮廓，已发现的人类NK细胞特异性识别受体包括活化受体和抑制受体两大类，其功能传递与膜内区的Ig样BCR功能区有关，长区者传递抑制信号(ITIM)，短区者传递活化信号(ITAM)，根据其结构和结合特性已描绘出三大类(NKG2、ILT、KIR)共30余种。T淋巴细胞和B淋巴细胞主要司职适应性免疫，这些功能以固有免疫力为基础，即从某种意义上讲T淋巴细胞和B淋巴细胞的作用是以NK细胞为基础的。将NK细胞的功能和机制彻底阐明不仅对揭开固有免疫力之谜至关重要，而且还会揭开适应性免疫的奥秘。
(2)NK细胞的生物学功能特点：从细胞表型来看，NK细胞既不是T淋巴细胞，也不是B淋巴细胞。NK细胞没有Ig或TCR基因重排，也不表达CD3分子。目前常用于检测NK细胞的标记有CD16、CD56、CD57、CD59、CD11b、CD94和LAK-1。NK细胞表达众多表面分子，但只具有相对特异性。通常将CD56+CD16+CD3-TCR-BCR-淋巴样细胞定为NK细胞，并以CD56的表达密度不同，将NK细胞分为CD56bright和CD56dim两群。另有约10%的NK细胞表型为CD56bright CD16dim或CD56bright CD16-。CD56brightNK细胞高表达CD56、CD94/NKG2A和L选择素(CD62L)，低表达CD16和KIR，而CD56dimNK细胞高表达CD16、PEN5、KIR和LFA-1，低表达CD56、CD94/NKG2A。
NK细胞固有免疫的反应特点：①NK细胞无MHC限制，不依赖抗体，无须抗原预先致敏，就能杀伤病毒感染细胞或某些肿瘤细胞；②刺激物可为各种病毒、肿瘤或某些生物反应调节剂(如ConA、Poly IC、LPS、IL-2、IL-12、IL-15、IL-18等)，仅仅在刺激后数小时或十几小时发生；③早期活化标志(CD69、CD45RO、CD25)出现频率可达85%以上；④可伴随着细胞因子(IFN-γ和TNF-α)、杀伤分子(Perforin、FasL、TRAIL)和杀伤受体(NKG2系统、KIR系统)的活化而迅速活化；⑤无记忆反应或二次刺激增强反应。
(3)肝脏NK细胞在肝病(病毒、肿瘤、自身免疫性疾病)中的意义：肝病种类繁多，其中病毒感染性疾病(含引起自身免疫损伤)和肿瘤发生与转移所占比例最大。现已证实，肝脏NK细胞在抗病毒(CMV、EBV、AV、AIDS等)和抗肿瘤(原发与转移)中作用巨大，NKT淋巴细胞则在自身免疫性肝损害中担当主角。这些结果大多通过细胞敲除鼠或抗体清除鼠获取，但机制不详。NK细胞在体内针对病毒感染细胞的作用不需要特异性抗原的刺激，免疫复合物、靶细胞表面结构及某些细胞因子均可直接诱导NK细胞的快速免疫反应，并可在数小时至一天内达到高峰。NK细胞在抗病毒感染中至少表现出以下两个方面的功能：首先，NK细胞能直接杀伤被感染的细胞；其次，NK细胞能够分泌大量的具有抗病毒效应的炎性细胞因子。NK细胞被触发的第一个反应是迅速分泌大量细胞因子(TNF-α、IFN-γ、IL-3、GMCSF、MCSF等)，其中 IFN-γ的作用至关重要。目前的研究已证实，NK细胞在抗病毒过程中发挥着重要的作用。
(4)NK细胞在HBV感染及乙型肝炎重症化中的作用：近年来，NK细胞在机体抗 HBV感染中的作用(细胞毒作用和非细胞毒作用)越来越受到关注。在正常的肝脏中，NK细胞和NKT淋巴细胞是非常丰富的，分别占肝内淋巴细胞的37%和26%，在肝脏发生炎症反应的情况下，肝内NK细胞可增至90%。在HBV感染过程中，NK细胞和NKT淋巴细胞可能通过以下方式发挥重要的抗病毒作用：①直接的细胞毒效应；②分泌干扰素等细胞因子，通过非细胞损伤的方式(NO依赖的途径)抑制病毒的复制；③分泌IFN，增加肝细胞MHC-Ⅰ类分子的表达，激活病毒特异性T淋巴细胞反应，抑制HBV复制和导致肝脏损伤；④调节获得性抗病毒免疫反应。
NK细胞对HBV感染肝细胞的直接杀伤作用：由于NK细胞受体的特点，其抑制性受体(Ly49、CD94/NKG2、KIRs)识别感染细胞表面的MHC-Ⅰ类分子时将转导抑制信号，抑制NK细胞的活性。NK细胞的这种特点对那些低表达或者不表达MHC-Ⅰ类分子的细胞来说是十分重要的，肝细胞就是一类几乎不表达MHC-Ⅰ类分子的细胞，故NK细胞在病毒感染早期、病毒感染肝细胞MHC-Ⅰ类分子表达上调之前其抗病毒作用更为重要。与T淋巴细胞不同的是，NK细胞的杀伤活性无MHC限制，可通过颗粒状胞吐方式(穿孔素和颗粒酶B)或死亡受体(如 Fas/FasL、TRAILR/L、TNF-α)途径直接杀伤缺乏MHC-Ⅰ类分子表达的病毒感染肝细胞。
NK细胞同时可以被其他活化的细胞如 NKT淋巴细胞、抗原呈递细胞所激活，而后通过分泌IFN-γ等细胞因子来抑制HBV的复制。同时，IFN-γ也是NK细胞的有效刺激剂，可诱导NK细胞发挥杀伤功能，同时调节其杀伤效应、增殖程度、分泌细胞因子的能力等。
NK细胞还是获得性细胞免疫的核心调节细胞，作用于CD4+T淋巴细胞和CD8+ CTL细胞以强化适应性免疫力；同时通过其具备的CD16分子辅助B淋巴细胞行使功能。因此，肝脏内NK细胞的活化在机体抗病毒过程中有着极其重要的意义。
NK细胞的抗病毒作用还受到其他多种细胞因子的调节，如 IL-12、IL-15等。研究发现HBV感染急性期患者血清 IL-2水平明显升高，IL-2通过激活NK细胞及CD8+T淋巴细胞来清除病毒，Echevarria等进一步研究发现，在机体全面启动特异性杀伤反应之前，HBV复制的控制与IL-2和NK细胞反应之间呈正相关。然而在慢性 HBV感染过程中，活化细胞表面的IL-2R链分离水平明显升高，这将阻止由IL-2诱导的免疫反应，也就是说慢性HBV感染可能与肝脏内NK细胞的活化程度降低有关。目前尚没有文献报道有关肝脏内NK细胞直接活化后发挥抗病毒作用的研究，病毒进入肝脏后通过哪些途径激活NK细胞还需进一步研究，但是NK细胞通过分泌IFN抑制病毒复制已经得到肯定。IL-18通过活化肝脏内的 NK细胞、NKT淋巴细胞分泌IFN-γ抑制HBV复制，且不需要其他炎性细胞的帮助，同时亦诱导分泌IFN-γ。IL-12亦可通过活化肝内NK细胞分泌IFN-γ抑制肝脏内病毒的复制，研究表明，IFN-γ可再诱导其他细胞因子TNF-α、IFN-γ的产生，这些细胞因子也具有抑制病毒复制的能力。而且在一定量IL-12的作用下，产生明显的抑制病毒复制作用时并不造成肝损害，肝脏内没有其他炎性细胞的浸润，可以推测，NK细胞活化在一定程度上可以产生有效的抗病毒作用而不造成肝损害。这一点也证明了非细胞毒性的抗病毒作用机制的存在。
(5)NK细胞在乙型肝炎重症化中的功能调节：陈韬等通过基因芯片技术发现在HBV相关慢加急性肝衰竭(HBV-ACLF)患者外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)中，一种离子通道相关基因KCTD9表达显著增加，并进一步验证该分子在HBV-ACLF患者外周血及肝脏NK细胞中表达显著增加，并与患者肝损害程度(ALT/AST)呈正相关。体外利用KCTD9表达质粒转染NK92细胞后观察到细胞活化、功能和毒性增强。同时，在鼠肝炎病毒3型(MHV-3)诱导的暴发性肝衰竭小鼠模型的研究中发现，肝脏NK细胞表达KCTD9亦显著上调，利用针对KCTD9分子的特异性shRNA干扰技术能使小鼠存活率由0上升至22%，肝脏功能及组织病理学显著改善，同时肝脏NK细胞表达KCTD9显著下调，活性及功能降低。同时研究发现在KCTD9敲除小鼠体内，NK细胞的发育成熟障碍及功能受限，提示一种新型的离子通道相关基因KCTD9可能通过活化NK细胞来介导重型肝炎、肝损害。
总之，NK细胞在乙型肝炎，尤其是乙型重型肝炎中的作用机制，目前的研究还非常缺乏，且研究大多数集中于外周血NK细胞。对肝脏内NK细胞的研究报道仍很少。事实上肝脏内聚集着大量的 NK细胞，约占肝脏淋巴细胞总数的37%。有学者推测，如此多的NK细胞聚集在肝脏内一定会行使其特定的功能。Dunn等指出，在慢性活动性 HBV感染时，IFN、IL-8等细胞因子可直接活化NK细胞，通过TRAIL介导的肝细胞凋亡途径导致肝脏出现炎症。目前利用HBV转基因小鼠得到的研究结果证明，肝脏内NK细胞在机体抗 HBV 感染中起着不可忽视的作用。在一个HBV转基因小鼠模型中，研究者发现在HBV感染时，肝细胞NKG2D配体(Rae-1或Mult)的表达增加，活化的NK细胞能够通过NKG2D /(Rae-1或Mult)途径识别感染的肝细胞，诱发严重的肝损害。Ghosh等研究发现在HBeAg阴性的慢性乙型肝炎患者体内，NK细胞通过穿孔素及TRAIL介导的细胞毒作用抑制具有抗病毒作用的CD4+T淋巴细胞释放干扰素等效应物质，进而导致肝脏损伤。宁琴等的研究首次在病毒诱导的暴发性肝炎模型中揭示，在MHV-3诱导的小鼠暴发性肝炎模型中，NK细胞在暴发性肝衰竭肝损伤中发挥重要作用。研究发现MHV-3感染BALB/cJ小鼠后，肝脏NK细胞逐渐由外周器官募集到肝脏中，而且随着感染时间的延长，NK细胞逐渐活化，对病毒感染肝细胞表现出显著的杀伤作用，这种细胞毒效应可由死亡受体途径Fas-FasL及NK细胞受体配体途径NKG2D-NKG2DL介导。同时还发现，在HBV-ACLF患者体内，肝脏NK细胞募集以及外周NK细胞FasL和杀伤性受体(NKp30 and NKp46)表达的上调与病情进展相关。此外，有报道指出，在四氯化碳(CCl4)诱导的小鼠肝纤维化模型中，NK细胞可杀伤高表达NKG2D配体Rae-1的肝星状细胞。表达TRAIL的NK细胞显示出较强的杀伤原代肝细胞的能力，从而导致肝损伤。
2.NKT淋巴细胞在乙型肝炎重症化中的作用
NKT淋巴细胞在HBV感染及乙型肝炎重症化中的作用：NKT淋巴细胞是自然杀伤细胞的T淋巴细胞亚群，能同时表达T淋巴细胞和NK细胞的受体，可分为CD4+和CD8+NKT淋巴细胞两个亚群。目前对于NKT淋巴细胞在HBV感染中的作用机制，主要是利用HBV转基因动物来研究肝脏内NKT淋巴细胞在HBV感染过程中的作用，研究表明，活化的NKT淋巴细胞能够抑制HBV的复制，并在抗病毒的同时造成肝损害。
NKT淋巴细胞受CD1d分子限制，在HBV感染时，HBV及其亚病毒颗粒(包含有糖脂和磷脂)被CD1d+细胞呈递给肝脏内NKT淋巴细胞，激活NKT淋巴细胞。活化的NKT淋巴细胞除了直接杀伤肝细胞外，还可以进一步激活NK细胞，使其细胞毒活性增加。另外，近几年发现一种非经典的NKT淋巴细胞，它受CD1d限制，却对半乳糖脑苷脂无反应。NKT淋巴细胞一方面通过自身分泌的细胞因子来发挥抗病毒作用，另一方面还通过活化其他淋巴细胞来进一步抗病毒。肝脏内NKT淋巴细胞在其特异性刺激剂GalCer的作用下，迅速活化并产生细胞因子IFN-γ和IFN-α/β，抑制HBV转基因小鼠肝脏内病毒的复制，同时导致肝损害(大量的淋巴细胞浸润、肝细胞坏死)。这种病毒抑制作用与GalCer的作用剂量、作用时间呈依赖性，提示它与NKT淋巴细胞的活化程度及所产生的细胞因子水平有关。曾有文献报道，肝脏内HBV特异性杀伤T淋巴细胞通过分泌IFN-γ、Poly I/ C通过诱导产生IFN而发挥抑制病毒复制的作用，这一点与肝脏内NKT淋巴细胞的抗病毒作用相似。活化的NKT淋巴细胞还可以通过其分泌的细胞因子激活肝脏内NK细胞，并导致该NK细胞大量分泌IFN-γ而发挥抗HBV作用。NKT淋巴细胞分泌IFN-γ的同时诱导肝脏实质细胞(肝细胞)及非实质细胞(Kupffer细胞、浸润的炎性细胞)表达趋化细胞因子CXCL9、CXCL10，进而趋化一系列表达CXCR3的炎性细胞浸润肝脏，并导致肝脏炎性损伤。CXCL9和CXCL10本身并不具有抑制病毒复制的作用，对 IFN-γ介导的抑制作用也没有调节作用，NKT淋巴细胞分泌的IFN-γ介导的抗病毒作用亦不受肝脏内浸润的多种炎性细胞的限制，提示NKT淋巴细胞产生的IFN-γ具有强烈抗病毒作用，如果在保证IFN-γ抗HBV的同时阻断其后续的炎症过程(如阻断CXCL9和CXCL10的功能)，极有可能寻找出一种治疗HBV肝炎的新途径。
上述推测在另两个实验室的工作中亦得到回应。Jody等在HBV转基因小鼠体内发现NKT淋巴细胞的另一个非经典亚群(CD1d限制、V14、不识别特异性激活剂GalCer)，该NKT淋巴细胞亚群通过分泌IFN-γ抑制HBV的复制继而通过该细胞分泌的其他细胞因子大量动员后续的适应性免疫细胞并引起肝损害。Guidotti等对急性感染HBV的黑猩猩的研究发现，其肝脏中HBV DNA 随着 IFN-γ的出现而大部分消失，肝脏并未出现相应的损伤，也没有大量的CD3+T淋巴细胞出现，这说明体内确实存在非细胞毒性的抗HBV机制，而且这种发挥非细胞毒性作用的细胞因子IFN-γ可能是由NKT淋巴细胞或NKT淋巴细胞活化的NK细胞产生的。肝脏内NKT淋巴细胞在HBV感染中的抗病毒作用已经得到肯定。肝脏内存在的大量NKT淋巴细胞直接在肝脏内行使抗病毒作用，而无须从肝脏外招募入肝脏。由于NKT淋巴细胞活化受体的特殊性，一旦存在合适的配体，NKT淋巴细胞将被有效地激活。HBV病毒颗粒及亚病毒颗粒均含有糖脂及磷脂，可通过CD1d+细胞呈递给肝内的NKT淋巴细胞，直接活化NKT淋巴细胞；NKT淋巴细胞还可以通过非TCR(NKR P1受体)识别配体或识别MHC-Ⅰ类分子表达缺陷的细胞而直接活化。同时NKT淋巴细胞亦可在病毒诱导产生的细胞因子的作用下间接活化。NKT淋巴细胞活化后将通过上述多种途径来发挥抗HBV作用。由于NKT淋巴细胞不识别病毒蛋白抗原，故慢性HBV感染者体内NKT淋巴细胞不可能被清除，这一点在转基因动物体内也得到证实。如果能够激活慢性HBV感染者肝脏内的 NKT淋巴细胞，这种固有免疫应答的抗病毒作用将成为慢性HBV感染者处于免疫耐受状态的特异性T淋巴细胞应答的一个补偿。
小鼠肝淋巴细胞中含有约30% NKT淋巴细胞，当施行肝部分切除术或者肝缺血再灌注时可以升高到50%~60%，提示NKT淋巴细胞与肝损害具有一定的关系。对NKT淋巴细胞与HBV感染的研究只是局限于对实验性乙型肝炎转基因小鼠的研究，利用这个模型，Kakimik发现肝组织内激活的NKT淋巴细胞和随后转化激活的NK细胞分泌的IFN-γ具有抑制HBV复制的效果，而且肝组织内激活的具有分泌IFN-γ能力的NKT淋巴细胞的数量也明显增多。在患者体内，NKT淋巴细胞对乙型肝炎疫苗特异性反应的形成是非常重要的。NKT淋巴细胞在HCV感染和清除中的作用还不清楚，在慢性HCV感染患者的肝组织中，NKT淋巴细胞的数量增加，并且表达了细胞激活的表面标志。研究发现，在 HBV转基因小鼠急性肝炎模型中，活化的非经典的NKT淋巴细胞可介导急性肝炎和肝损害，阻断NKG2D与其配体的相互作用可完全阻断其引起的肝损害。Wu等研究发现，在小鼠急性暴发性肝炎模型中，活化的NKT淋巴细胞能够通过细胞间的接触作用诱导MDSCs向促炎性方向分化，打破自身的免疫抑制状态，分泌炎症因子，加重肝脏损伤。
3.巨噬细胞在乙型肝炎重症化中的作用
目前已知巨噬细胞在乙型肝炎重症化中的作用机制如下。
(1)分泌细胞因子：肝脏内的巨噬细胞、DC等活化后亦分泌多种细胞因子发挥抗病毒作用。CD40活化肝脏内APC(如巨噬细胞、DC等)后，APC分泌炎性细胞因子(IL-12、TNF-α)，并趋化多种细胞(DC、巨噬细胞、T淋巴细胞、NK细胞、NKT淋巴细胞等)浸润肝脏组织，继而诱导活化NK细胞、NKT淋巴细胞、T淋巴细胞分泌IFN-γ或IFN-α/β来抑制肝脏内病毒的复制，并导致肝脏出现明显的炎性病变和损伤。APC的这种作用是不依赖于T淋巴细胞的，通过活化 APC来治疗慢性HBV感染者可能会成为一种新的治疗策略。另外，利用P.yoelii感染鼠的红细胞激活转基因小鼠肝脏内的巨噬细胞后，其产生的细胞因子亦可抑制肝脏内 HBV 的复制，提示肝脏内的巨噬细胞具有抗病毒作用。
(2)巨噬细胞与免疫凝血系统：巨噬细胞激活后产生的凝血酶原酶，能促进凝血级联反应，在重型肝炎发病中的作用也越来越受到重视。在病毒性肝炎中，炎症发生的同时往往伴有凝血纤溶系统的激活，该过程中可产生直接导致炎症作用的因子，如凝血酶Ⅹa因子、纤维蛋白原等，最终引起纤维蛋白的沉积、微血管血栓的形成、白细胞聚集以及炎症反应的上调。有研究表明，凝血酶是肝损害的关键介质，特别是在重型病毒性肝炎疾病中，凝血酶的局部聚集可以解释疾病过程中的微循环内凝血机制紊乱、微血栓形成、组织缺血缺氧及迅速大面积的肝细胞坏死等典型病理生理学改变。免疫凝血途径的激活在重型肝炎的发生及发展中占有重要的地位。
fgl2凝血酶原酶/纤维介素是由活化的巨噬细胞或内皮细胞表达的一种新型的凝血酶原酶分子，属于纤维蛋白原超家族的一员，能够直接裂解凝血酶原而启动免疫凝血途径。跨膜型fgl2由活化的巨噬细胞或内皮细胞表达，具有凝血酶原酶的功能，能催化凝血酶原转化为凝血酶，启动凝血级联途径，促使纤维蛋白原转化为纤维蛋白，促进血栓形成。系列研究表明，fgl2凝血酶原酶在乙型重型肝炎患者的外周血PBMC和肝组织中特异性高表达，且与疾病的严重程度相关。fgl2可启动局部的凝血过程，导致纤维蛋白沉积、微血栓形成、微循环障碍和局部炎症反应，此系重型肝炎肝细胞坏死的重要分子机制之一，减少和阻断其表达有可能为防治重型肝炎提供新的方法和途径。在小鼠暴发性肝炎模型的体内实验中发现，进一步运用针对fgl2的特异性反义RNA进行干预，可使暴发性肝炎小鼠的生存率由0提高到33.3%，提示了fgl2在乙型重型肝炎发生、发展中的重要作用。在病毒蛋白对fgl2基因调控作用的研究中，宁琴等在小鼠暴发性肝炎模型中发现 MHV-3的核心蛋白可激活小鼠fgl2基因的启动子活性，并提出在启动子2372至2306(相对于ATG翻译起始点)位置，存在着对转录、激活起重要作用的反式作用因子作用位点，肝细胞核因子4(HNF4)这一肝脏特异性转录因子可与之结合，启动该基因的转录和激活。
4.其他固有免疫细胞在乙型肝炎重症化中的作用
(1)γδT淋巴细胞：γδT淋巴细胞同时具有辅助T淋巴细胞(Th)、CTL、自然杀伤(NK)细胞等多种免疫细胞的特点，其TCR仅有有限的可变性。γδT淋巴细胞是介于先天性免疫与适应性免疫之间的一种免疫细胞。一方面，γδT淋巴细胞可认为是特异性免疫的一部分，它可通过V(D)J重排而产生连接区的多样性，并产生记忆表型。但另一方面，γδT淋巴细胞的不同亚型也可认为是非特异性免疫的一部分，其细胞表面限制的TCR受体或NK细胞受体可作为模式识别受体。大量的Vγ9/Vδ2 T淋巴细胞亚型可在数小时内迅速对细菌产生的共同分子(IPP等)做出免疫反应，同时，高度限制的上皮内Vδ1 T淋巴细胞亚型可对刺激的上皮细胞发生反应。外周血γδT淋巴细胞在结核病、麻风、疟疾等感染性疾病中可显著增殖，其机理主要是细菌或受感染的细胞产生的中间代谢产物(脂质小分子如IPP等)或蛋白配体可激活Vγ9/Vδ2/T淋巴细胞亚型发挥功能。而Vδ1 T淋巴细胞亚型在HIV患者中是主要的增殖亚型。
同时，在不同的病毒感染性疾病中，γδT淋巴细胞的不同亚型可表现出不同的免疫效应。如在柯萨奇病毒B3诱导的小鼠心肌炎模型中，Vγ1 T淋巴细胞亚型对抑制心肌炎发生可起到免疫保护作用，而Vγ4 T淋巴细胞亚型却可促进炎症发生。γδT淋巴细胞在多种病毒感染诱发的机体免疫病理过程中均有重要作用。
γδT淋巴细胞对抗原的非MHC限制性和无须抗原处理和呈递识别方式提示，在机体内出现异常变化(如应激反应)时，γδT淋巴细胞可做出比αβT淋巴细胞更迅速的反应。γδT淋巴细胞可对αβT淋巴细胞不能识别的抗原产生应答，在功能上与后者实现互补。在历经长期进化后，相比于αβT淋巴细胞，γδT淋巴细胞以更广泛、快速和直接的方式对体内应激事件做出反应，同时其反应手段较为笼统，即γδT淋巴细胞可同时发挥细胞毒效应和分泌细胞因子的双重作用。γδT淋巴细胞的细胞毒效应功能包括杀伤NK敏感和NK不敏感的靶细胞，IL-2能够明显增强γδT淋巴细胞的杀伤力。γδT淋巴细胞也具有分泌细胞因子的功能，已发现γδT淋巴细胞能分泌IL-4、GMCSF和IFN-γ，通过抗γδTCR抗体诱导某些γδT淋巴细胞分泌IL-2和溶解靶细胞。然而，γδT淋巴细胞抗原识别的多样性和机制的复杂性使人们目前还难以概括γδT淋巴细胞全部的生物学意义。
目前对于γδT淋巴细胞在乙型肝炎重症化中作用的研究甚少，对慢性病毒性肝炎的研究发现，HBV和HCV感染者肝脏内含有大量的γδT淋巴细胞，且HCV患者肝内γδT淋巴细胞对多种靶细胞具有非 MHC 限制的高水平细胞毒作用，并能在 anti-CD3的作用下活化产生细胞因子 IFN-γ、TNF-α、IL-8等，故推测γδT淋巴细胞在病毒感染中可能起作用。任红等的研究显示，乙型重型肝炎患者γδT淋巴细胞有显著增强的杀伤或溶解靶细胞的潜能，即高表达CD56、CD107a、颗粒酶B(granzyme B)等分子，高水平地分泌IFN-γ、TNF-α、IL-17等细胞因子。同时，乙型重型肝炎患者γδT淋巴细胞可能对CD4+T淋巴细胞有一定的调节作用：使CD4的CD27、CD45RO等表达降低；而分泌IFN-γ或TNF-α增加，这些功能改变均可导致乙型肝炎重症化的发生。
(2)DNT淋巴细胞：2000年，CD3+CD4-CD8-双阴性(DN)T淋巴细胞首先被鉴定为一群具有免疫抑制功能的特殊的调节性T淋巴细胞。近年来有研究显示，DNT淋巴细胞是一类新型具有不同免疫活性的T淋巴细胞亚群，可以在不同类型疾病中抑制或者增强免疫反应，导致不同疾病转归。宁琴研究小组基于鼠肝炎病毒3型(MHV-3)感染敏感系BALBb/cJ小鼠建立了暴发性病毒性肝炎(FVH)模型，研究DNT淋巴细胞在FVH中的免疫学功能及其分子效应机制。结果发现，感染了MHV-3后，敏感系BALB/cJ小鼠引发FVH，其血清ALT、AST及TBil水平持续升高，肝细胞大块坏死，与此同时，其体内DNT淋巴细胞比例升高并高表达早期活化分子CD69；另外发现病毒感染后肝细胞具有对脾脏来源DNT淋巴细胞的趋化作用。该DNT淋巴细胞的表型和免疫学特征与以往报道的DNT淋巴细胞有所区别，主要由TCRαβ+亚群组成，并高表达CD44分子，除11.7% DNT淋巴细胞分泌IL-2外，基本不分泌IFN-γ、IL-10、IL-4、FasL、穿孔素(perforin)及颗粒酶(granzyme)等细胞因子。同时，DNT淋巴细胞在FVH进展过程中表达mfgl2，其主要表达于感染的DNT淋巴细胞膜上，在体外具备促凝血活性(PCA)。转移过继实验显示，感染MHV-3后的BALB/cJ小鼠接受过继活化的DNT淋巴细胞后，病情进展加重，生存时间缩短，肝细胞坏死区显示mfgl2分子表达增强及大量纤维素沉积。使用Ad-mfgl2-microRNA体内干扰BALB/cJ小鼠的mfgl2表达，小鼠生存率提高至33.3%，同时可以减轻DNT淋巴细胞过继小鼠的血清学及组织学改变。本研究结果提示，在感染MHV-3后，DNT淋巴细胞从脾脏迁移到肝脏，并大量活化，其表面高表达的mfgl2分子可能是MHV-3诱导的FVH发病过程中一个重要的效应分子。
(3)Kupffer细胞：早在1989 年，有人发现在亚急性重型肝炎浸润的单个核细胞中以Kupffer细胞为主，随后的研究发现活化的Kupffer细胞分泌多种细胞因子，随之影响其他免疫细胞和肝细胞的免疫反应，以及组织损伤程度。其形成的细胞因子网络在重型肝炎发病机制中具有重要的作用，其中发挥主要作用的是肿瘤坏死因子，此外尚有IL-1、IL-6、IL-8等。正常情况下，肝脏内的Kupffer细胞以M2型为主，以维持肝脏内的免疫耐受状态。在急性重型肝炎早期，活化的Kupffer细胞表现出M1型，分泌炎性介质促进肝细胞损伤。在急性重型肝炎的缓解期，Kupffer细胞更多地表现出M2型的特点，产生抗炎因子和促细胞增殖因子来促进肝脏的修复。研究发现，在伴刀豆球蛋白A(concanavalin A，ConA)诱导的急性暴发性肝衰竭小鼠模型中，观察到了肝脏内的Kupffer细胞的凋亡和功能障碍，且伴有巨噬细胞相关促炎因子的上调，这些结果提示肝脏巨噬细胞的失活和凋亡可能与急性重型肝炎进展密切相关。在接受肝移植后出现急性重型肝炎的患者中发现肝脏内的Kupffer细胞高表达FasL，提示Kupffer细胞可能通过Fas/FasL途径造成严重的肝损伤。
(4)DC：作为最重要的抗原呈递细胞，DC在HBV感染及慢性肝炎过程中发生功能性异常已经被很多研究所报道。研究认为，DC功能的缺陷是造成慢性病毒性肝炎感染者体内缺乏有效的 CTL应答的重要原因。同时，DC作为病毒感染的靶细胞，可被特异性的 CTL识别并攻击，导致数量减少和功能下调。另外，DC也很可能作为一种病毒“避难所”，逃避免疫系统的攻击，导致慢性肝炎。Kurose等利用携带 HBV的小鼠模型研究发现，小鼠体内可表达丰富的HBsAg，但不产生抗-HBs，且其体内DC表达的CD86等明显低于正常小鼠，表现出非成熟特征。当用IFN-γ治疗后，DC表面MHC-Ⅱ类分子的水平明显上升，提示IFN-γ可上调MHC-Ⅱ类分子的表达。利用转基因小鼠的淋巴细胞与HBsAg及弗氏完全佐剂混合培养，同时加入来源于相同年龄、性别及MHC-Ⅱ类分子相匹配的正常小鼠的DC，可产生持续高滴度的抗-HBs，证明携带HBV的转基因小鼠产生抗-HBs能力的丧失是由DC的功能缺陷所致。总之，在慢性乙型肝炎患者体内，DC存在着不同程度的功能缺陷，可能是慢性HBV感染易迁延不愈的重要因素。目前，人们已经能用各种类型的 DC疫苗治疗肝炎以及恶性肿瘤，并取得了较好的效果，提示DC疫苗作为一种打破免疫耐受，诱发抗肿瘤、抗病毒的免疫治疗药物有较好的临床应用前景。研究HBV感染后DC的功能降低或紊乱病变的内在分子机制，可为揭示乙型肝炎发病机制及临床治疗提供有用信息。
施光峰等的研究显示，HBV感染者DC频率减少、表型缺失、功能障碍程度与乙型肝炎重症化密切相关，而且重型肝炎患者体内分离出的外周moDC表现为IL-6、TNF-α分泌能力显著升高，这些功能性的改变与乙型肝炎重症化的发生密切相关。Khanam等发现ACLF患者接受粒细胞集落刺激因子(G-CSF)治疗后外周和肝脏内的髓样DC和浆样DC明显增多，同时患者血清胆红素水平下降，凝血功能有所恢复。
(5)中性粒细胞：中性粒细胞介导的肝损害主要通过介导各种炎性介质的活化及随后的趋化聚集于肝脏脉管系统。聚集的中性粒细胞感应来自肝实质产生的趋化信号，随后渗出并与肝细胞黏附。进一步触发中性粒细胞的活化，延长黏附依赖的氧化应激及脱颗粒。释放出的氧化物质向肝细胞弥散，激发细胞内氧化应激反应，线粒体功能紊乱，并最终引起细胞肿胀、凋亡和坏死。中性粒细胞在肝脏内浸润是肝损害、细胞应激及系统性炎症的最早期的反应。其可在1h内杀伤肝细胞，与细胞内氧化应激及线粒体功能紊乱相关；同时也可通过表达FasL，诱导表达Fas的肝细胞凋亡。然而，中性粒细胞可能通过多种机制参与FasL/Fas途径介导的肝损害，需要进一步研究证实。Huang等研究发现在小鼠缺血性肝损伤模型中，损伤相关分子模式(damage associated molecular patterns，DAMPs)的释放能够促进中性粒细胞通过Toll样受体4(Toll-like receptor 4，TLR-4)信号通路释放中性粒细胞诱捕网(neutrophil extracellular trap，NET)，进而促进炎症反应，加重肝细胞损伤。
(6)髓源性抑制细胞(myeloid-derived suppressor cells，MDSCs)：一类骨髓来源、具有免疫抑制活性的异质细胞群，该群细胞可以抑制T淋巴细胞的功能，负向调节免疫反应，影响疾病的转归。Zeng等研究发现HBV-ACLF患者外周血的CD14+ CD33+ CD11b+ HLA-DR-/low MDSCs的数量低于慢性乙型肝炎患者和健康对照者，同时伴随着患者体内的CD4+/CD8+T淋巴细胞的数量及表达的CD3 ζ 链降低，并且MDSCs的水平越高，患者的预后越差。Bernsmeier等的研究也表明在ACLF患者的外周血中CD14+ CD15-CD11b+ HLA-DR-MDSCs明显增多，能够显著抑制T淋巴细胞的增殖及TNF-α/IL-6等效应分子的释放，并且抑制其摄取细菌的功能，导致二次感染的发生。
(7)嗜酸性粒细胞：嗜酸性粒细胞可能参与某些肝病的发病，然而其作用机制仍不明确。在ConA诱导的免疫学肝损害模型中，观察到了肝脏嗜酸性粒细胞的浸润及IL-5的高表达。而在IL-5基因敲除的小鼠或嗜酸性粒细胞耗竭的感染小鼠中肝损害明显减轻。IL-5对嗜酸性粒细胞的成熟及功能起到了至关重要的作用，活化的NKT淋巴细胞也能分泌IL-5。上述发现表明，IL-5及嗜酸性粒细胞可能在实验性免疫性肝炎中发挥重要作用。此外，暴发性肝炎患者中，肝脏嗜酸性粒细胞数量增多，同时伴随IL-6的表达增高，而表达IL-6的嗜酸性粒细胞并不分泌IL-5。
(8)肝窦内皮细胞：肝窦内皮细胞不仅是机体窦腔与肝实质之间的生理屏障，也参与肝脏及全身性炎症所致的急性肝损害的发病。肝窦内皮细胞特异的功能表现为从肝窦中清除致炎症因子，如LPS，而不引起广泛的炎症。这种独特的能力来自其大量产生的抗炎因子以及其在接触致炎症因子后表达降低的黏附分子和抗原呈递共刺激分子。肝窦内皮细胞也表达MHC-Ⅰ类和MHC-Ⅱ类分子，在抗原呈递细胞刺激以后表达共刺激分子。肝窦内皮细胞凝集素最近被鉴定为DC-SIGN家族的一员，能特异性识别活化的T淋巴细胞并负向调节其免疫反应。缺血再灌注引起的肝损害中，肝窦内皮细胞通过表达B7-1和B7-2分子，起到抗原呈递细胞的重要作用。在LPS半乳糖苷和四氯化碳诱导的急性重型肝炎模型中，IL-1诱导肝星状细胞产生金属蛋白酶，随后导致细胞外基质变性退化，引起肝窦崩裂，导致肝实质细胞死亡，肝功能严重受损。
三、模式识别受体在乙型肝炎重症化中的作用
Toll样受体(TLRs)是近年来发现的一类模式识别受体(PRRs)，通过对病原体相关分子模式(pathogen associated molecule patterns，PAMPs)的识别，启动固有免疫和适应性免疫应答，在抗病原体感染中起重要作用。乙型肝炎的发病机制复杂，与肝细胞内HBV数量无明显相关性，而主要取决于机体的免疫应答，但其精确机制仍未完全阐明。因此，Toll 样受体作为固有免疫受体的重要成员，在乙型肝炎发生、发展中的作用及机制值得探讨。
1.Toll样受体分类
目前，在哺乳动物及人类中已经发现的人TLRs家族成员有11个。其中了解比较清楚的有TLR-2、TLR-4、TLR-5和TLR-9。人的TLRs家族基因分别定位于4号染色体(TLR-1、TLR-2、TLR-3、TLR-6、TLR-10)、9号染色体(TLR-4)、1号染色体(TLR-5)、3号染色体(TLR-9)、X染色体(TLR-7、TLR-8)。根据TLRs细胞分布特征，可将其分为普遍存在型(TLR-1)、限制存在型(TLR-2、TLR-4、TLR-5)及特异存在型(TLR-3)三类。
2.Toll样受体在固有免疫中的识别作用
Toll样受体如同固有免疫的眼睛，监视与识别各种不同的PAMPs，是机体抵抗感染性疾病的第一道屏障。其中TLR-4不仅可识别外源的病原体，还可识别内源性物质及降解物。TLR-4可以识别革兰阴性菌脂多糖(LPS)，还可识别宿主坏死细胞释放的热休克蛋白(heat shock protein，HSP)，体内肝素硫酸盐和透明质酸盐降解的多糖部分以及局部的内源性酶的级联活化反应也可激活TLR-4。TLR-2的配体较TLR-4更为广泛，包括脂蛋白、脂多肽、脂磷壁酸(LTA)阿拉伯甘露聚糖(LAM)及酵母多糖等。TLR-5可以识别鞭毛蛋白，鞭毛蛋白是目前发现的TLR-5的唯一配体。具有鞭毛蛋白的L型细菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌和鼠伤寒沙门菌等可被TLR-5识别。TLR-3特异识别病毒复制的中间产物dsRNA，从而激活NF-κB和IFN-β前体。Doyle等证实，抗TLR-3单克隆抗体能抑制成纤维细胞IFN-β的产生。Christopher等证实TLR-3还具有调控鼻病毒对人支气管细胞感染的能力，这也说明TLR-3在宿主抵抗活病毒中发挥重要的作用。TLR-7识别咪喹啉家族低分子的咪唑莫特、R848和R847等。TLR-7、TLR-8和TLR-9高度同源，在细胞内涵体中起作用。TLR-9识别细菌的CpG DNA，具有激活B淋巴细胞和APC的免疫刺激特性。
另外，TLR对配体的识别，不同类型的Toll样受体可以组合，从而识别不同的PMAPs，如TLR-1与TLR-6可以协同TLR-2对不同的PMAPs分子进行组合识别；TLR-7可能同TLR-9组合来介导CpG激活免疫细胞。其中TLR-4/TLR-4和TLR-9/TLR-9是以同源二聚体的形式进行组合的；而TLR-2/TLR-4、TLR-2/TLR-6和TLR-7/TLR-8为异源二聚体，还有的二聚体中有一个亚单位尚未确定，如TLR-3/TLR、TLR-5/TLR。
3.Toll样受体的表达与HBV感染
Toll样受体在肝脏内的多种细胞(如Kupffer细胞、NK细胞、肝窦内皮细胞、肝星状细胞)中均可少量表达，但一般表达量低。Matsumura等研究表明，肝细胞上亦有Toll样受体表达，某些炎症因子或前炎症因子如IL-1、表皮生长因子可以上调Toll样受体的表达。Ratnam和Visvanathan等研究发现HBeAg 阳性患者肝细胞TLR-2的表达量下降，HBeAg阴性患者的TLR-2表达增强，TNF分泌增加。在慢性乙型肝炎及慢性乙型重型肝炎患者肝组织中，TLR-2和TLR-4表达增强，且与肝组织炎症活动分级呈正相关。同时实验表明：TLR-2、TLR-4在肝癌细胞株HepG2、HepG2.2.15中表达量升高，后者升高更明显。用不同浓度的 LPS 处理HepG2、HepG2.2.15细胞，TLR-2 和TLR-4表达量增加，相同刺激条件下，HepG2.2.15细胞表达量明显高于HepG2细胞，TLR-4的表达明显高于TLR-2。对急性重型肝炎的大鼠腹腔注射NF-κB特异性抑制剂二硫氨基甲酸酞吡咯烷(PDTC)以抑制TLR-4信号转导通路，发现PDTC干预能在一定程度上减轻肝损害。说明TLR-4/NF-κB途径在LPS诱导的肝损害中起重要作用。HBV感染可以上调肝细胞TLR-2和TLR-4的表达，加重肝损害，成为乙型肝炎重症化的又一重要影响因素。Khvalevsky等研究报道，TLR-3在肝瘤系Huh7细胞上表达量下降，在HBV全基因组转染的HepG2.2.15细胞TLR-3表达上调的同时出现细胞凋亡现象，揭示HBV可能直接上调 HepG2.2.15细胞的TLR-3表达，而且可能启动了细胞凋亡或坏死机制。
Visvanathan等发现慢性乙型肝炎(CHB)患者外周血单个核细胞TLR-2表达量与HBeAg有关，而与病毒载量无明显相关性。HBeAg阴性患者的PBMC中TLR-2表达增强，相关的TNF-α分泌增加，而HBeAg 阳性患者PBMC表达TLR-2下降，TNF-α水平亦显著下降。慢性重型肝炎患者PBMC的TLR-2、TLR-4 表达强度和血清TNF-α水平较对照组显著升高，且TLR-2与TLR-4呈正相关。慢性重型肝炎患者 PBMC中TLR-4表达水平与血清IL-6表达水平呈显著正相关，存在 PBMC 中TLR-4过表达现象。Han等人研究发现在急性重型肝炎患者体内TLR-2的表达降低，同时给TLR-2突变的小鼠注射HBV质粒时，肝脏的炎症反应较野生型明显，提示这可能与调节性T淋巴细胞(Treg)数量降低有关。Hermoso等研究证实 TNF-α可上调 TLR-2和TLR-4的表达，IL-6上调TLR-4的表达，而TNF-α的水平与肝脏炎症程度相关，TNF-α的过度升高与预后不良有关，提示CHB患者高水平的TNF-α可能是导致PBMC中TLR-2、TLR-4表达上调的重要因素。此外，慢性乙型肝炎和肝癌患者的PBMC 中 TLR-7和TLR-9 mRNA表达下降，TLR-7蛋白表达下降，但TLR-9在蛋白水平上却随着病程进展及原发性肝癌的发生呈现上升的趋势。亦有研究报道，慢性乙型肝炎患者PBMC中TLR-1/2/4/6 mRNA的表达较健康人下降，提示Toll样受体的异常表达与慢性乙型肝炎的发病以及乙型肝炎重症化机制有关。
健康人未成熟外周血单个核细胞来源的髓样树突状细胞(mDC)经多聚次黄苷酸-胞苷酸(polyI：C)刺激后TLR-3表达上调，而HBeAg 阳性的慢性乙型肝炎患者mDC经polyI：C刺激后TLR-3出现异常表达，表现为TLR-3表达上调时间晚，上调的速度慢，同时协调刺激因子CD86表达低下，提示TLR-3和CD86的异常表达可能与HBV的持续性感染有关。Xu等研究发现TLR-7、TLR-9在慢性乙型肝炎患者外周血单个核细胞来源的浆细胞样树突状细胞(pDC)中的表达显著减弱，且pDC功能受损，从而导致HBV的持续感染与肝炎的慢性化。TLR-7在慢性乙型肝炎患者mDC不同成熟阶段表达水平不同，但无论未成熟还是成熟阶段，TLR-7表达的水平均显著降低。而且DC表面分子CD80、CD83、CD86 的表达水平亦显著降低，提示DC的Toll样受体表达下降及功能损害可能是导致乙型肝炎慢性化的重要因素之一。
4.Toll样受体与乙型肝炎重症化
急性重型肝炎在临床上与内毒素休克具有相似的特点，表现为大量炎性细胞因子的产生、肝细胞损伤、血流动力学的紊乱以及昏迷。而Toll样受体对内毒素休克的发生及发展具有重要作用。促炎性细胞因子包括TNF、IL-1、IL-6、IL-12、IL-18和IFN-γ，对急性重型肝炎的病理生理改变及临床转归十分关键。
Toll样受体具有抗HBV作用。Wu等用TLR-1~TLR-9激动剂刺激C57BL/6野生型或myd88(-/-)小鼠非实质细胞，mDC上TLR-1、TLR-3、TLR-4、TLR-7和TLR-9的激动剂能诱导产生抗病毒因子，TLR-3、TLR-4激动剂刺激的Kupffer细胞和TLR-3激动剂刺激的内皮细胞具有抑制HBV复制的趋势。在myd88(-/-)小鼠实质细胞中得出了同样的结果，并证明了这一途径是TLR-4参与并通过IFN抑制HBV复制的。TLR-4还可通过诱导诱生型一氧化氮合酶(iNOS)的表达增加，以及HBV的特异性免疫反应，表现出抗 HBV活性，在HBV清除中起重要作用。Isogawa等研究显示TLR-3、TLR-4、TLR-5、TLR-7和TLR-9的特异性配体均可通过诱导IFN等细胞因子的产生抑制转基因小鼠肝脏 HBV DNA的复制。
TLR-4是一个重要的固有免疫受体，主要识别革兰阴性细菌脂多糖(即内毒素)、紫杉酚、丙型肝炎病毒的核心蛋白等，TLR-4尚能够识别内源性的热休克蛋白，凋亡细胞也可以激活TLR-4，对TLR-4配体引发的巨噬细胞炎症因子分泌有协同作用，可协同增强巨噬细胞对 IL-6等炎性介质的分泌。研究证实，在慢性乙型重型肝炎患者外周血中，存在单核细胞TLR-4的过度表达，且外周血单核细胞 TLR-4表达水平与血清IL-6表达水平存在密切关系。此外，Jiang等在脂多糖-D半乳糖(lipopolysaccharide-D galactosamine，LPS-D GalN)诱导的小鼠急性重型肝炎模型中发现用polyI：C预先注射的小鼠死亡率及肝损害程度明显降低，从而提示 TLR-3 信号的活化可通过下调巨噬细胞上的TLR-4 而减弱 LPS诱导的重型肝炎。Wang等在ConA诱导的小鼠急性重型肝炎模型中发现TLR-5敲除小鼠的肝损伤明显缓解，这一过程可能通过抑制T/NKT淋巴细胞的活化来实现。
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