凝血功能紊乱与肝衰竭
宁琴 严伟明
肝脏是大部分凝血因子、抗凝蛋白以及纤溶蛋白的合成场所，其网状内皮系统还能通过清除循环中活化的凝血因子、纤维蛋白及其调节物来维持凝血与纤溶之间的平衡。因此，肝损伤所致的凝血功能障碍在肝病进程中屡见不鲜，不仅是肝衰竭临床症候群的重要组成部分，也是患者治疗中的难题。国际权威肝病学术组织发布的肝衰竭防治指南中，均将国际标准化比值(international normalized ratio，INR)、凝血酶原时间(prothrombin time，PT)及凝血酶原活动度(prothrombin activity，PTA)推荐为评估患者凝血功能、指导肝衰竭临床诊疗的重要依据。然而，机体凝血、抗凝及纤溶系统错综复杂，彼此间存在交叉调节和反馈平衡，加之肝脏区域剧烈的炎症反应，仅通过INR等经典凝血参数很难准确反映出机体的出血或凝血倾向。因此，近年来，新型凝血评估指标的研究方兴未艾，新型生物靶向治疗的应用也初现端倪。本节中，我们将回顾凝血与抗凝血反应的生理学基础，并进一步阐述肝病患者，尤其是肝衰竭患者凝血功能紊乱的发生机制、干预策略及潜在的干预靶点。
一、凝血与抗凝血反应的生理学基础
(一)经典凝血理论——内源性/外源性凝血级联反应模型
血液凝固，简称凝血，是生理止血过程的重要环节之一。经典凝血理论以瀑布学说为代表，即认为凝血是多种凝血因子参与的、包含系列蛋白质有限水解的复杂生化反应过程，依次分为Ⅹ因子(factor Ⅹ，FⅩ)的激活、Ⅱ因子(factor Ⅱ，FⅡ，又称为凝血酶原(prothrombin))的激活，以及纤维蛋白的形成三个基本阶段。根据FⅩ的激活途径不同又可将凝血过程分为内源性凝血途径及外源性凝血途径。
1.内源性凝血途径
内源性凝血途径是由Ⅻ因子(factor Ⅻ，FⅫ)激活启动的、完全依赖血浆内凝血因子完成FⅩ激活的凝血途径。血管内膜损伤等因素直接激活FⅫ，使其转变为FⅫ a，FⅫ a激活前激肽释放酶(prekallikrein，PK)为激肽释放酶(kallikrein，KLK)，后者对FⅫ的正反馈激活作用可促进大量FⅫ a生成。在高分子激肽原(high molecular weight kininogen，HMWK)的参与下，FⅫ a激活Ⅺ因子(factor Ⅺ，FⅪ)为FⅪ a，FⅪ a再顺序激活Ⅸ因子(factor Ⅸ，FⅨ)为FⅨ a。最终FⅨ a与活化的Ⅷ因子(factor Ⅷ a，FⅧ a)、血小板3因子(platelet factor 3，PF3)及Ca2+共同组成“FⅧ复合物”，进而激活FⅩ转变为FⅩ a。PF3为血小板膜上的磷脂，FⅨ a与FⅩ分别通过Ca2+同时连接于此磷脂表面，FⅨ a随即促进FⅩ发生有限水解而激活生成FⅩ a。FⅧ是一种十分重要的辅助因子，虽然自身不能激活FⅩ，却能加快FⅨ a激活FⅩ的进程。因此，FⅧ缺乏的甲型血友病患者的凝血过程明显延长。
2.外源性凝血途径
外源性凝血途径是依赖于血管外组织释放的组织因子(tissue factor，TF)(又称为组织凝血活酶或Ⅲ因子(factor Ⅲ，FⅢ))完成FⅩ激活的凝血途径。TF为磷脂蛋白质，是凝血过程的重要启动者，广泛存在于血管外组织，其表达细胞类型包括活化的单核细胞、内皮细胞及血管平滑肌细胞。组织发生创伤时，TF即释放入血液，Ⅶ因子(factor Ⅶ，FⅦ)与FⅩ借助Ca2+结合于TF提供的磷脂表面，FⅦ首先被激活生成FⅦ a，随即催化FⅩ发生有限水解，生成有活性的FⅩ a。TF通路抑制剂(TF pathway inhibitor，TFPI)可与TF、FⅦ a及FⅩ a结合形成四聚体复合物，从而对外源性凝血途径发挥负性调控作用。
3.共同通路
共同通路是由内源性及外源性凝血途径生成的FⅩ a与活化的Ⅴ因子(factor Ⅴa，FⅤ a)、PF3及Ca2+形成“凝血酶原酶复合物”，进而激活凝血酶原(FⅡ)生成凝血酶(FⅡ a)的过程。FⅤ a本身不具备催化凝血酶原进行有限水解的功能，但可显著增强FⅩ a对凝血酶原的催化作用。凝血酶一方面可切割纤维蛋白原(又称为因子Ⅰ，factor Ⅰ，FⅠ)转变为纤维蛋白单体FⅠ a(又称为活化的 FⅠ)，另一方面可激活因子(factor ，F)生成F a。在F a的作用下，纤维蛋白单体相互连接，形成牢固的纤维蛋白多聚体，即血纤维。此时凝血酶活化的纤溶抑制剂(TAFI)亦被充分激活，生成的TAFI a可通过抑制纤溶酶原的活化来阻止血栓的溶解进程。
(二)现代凝血学说——基于细胞的凝血模型
近年来凝血研究获得了较快的进展并更新了诸多概念，尤其是TF-FⅦ a复合物可同时活化内源性和外源性凝血系统的发现使人们意识到，两条凝血途径并非截然分开、彼此平行，而是互相联系的。加之人们对血小板研究的不断深入，逐渐衍生了以“基于细胞的凝血模型”为主题的现代凝血学说。与经典的内源性和外源性凝血级联模型不同，基于细胞的凝血模型更加强调直接参与凝血过程的细胞(如表达TF的细胞和血小板)与凝血因子之间的相互作用。该模型将凝血过程分为以下三个阶段。
1.启动阶段
当血管受损时，携带有TF的细胞结合并活化FⅦ，即为凝血过程的启动阶段。TF-FⅦ a复合物可激活FⅨ与FⅩ，分别生成FⅨ a及FⅩ a，FⅨ的激活成为连接内源性凝血途径与外源性凝血途径的桥梁。FⅨ a与FⅧ a、PF3及Ca2+共同组成“FⅧ复合物”，促进FⅩ a的生成。FⅩ a与FⅤ a、PF3及Ca2+形成“凝血酶原酶复合物”，激活凝血酶原，产生微量的凝血酶。与此同时，受损的血管内皮暴露出内皮下组织中的Ⅰ型胶原与Ⅲ型胶原，两者的活性部位可通过血管性血友病因子(von Willebrand factor，vWF)与血小板膜上的受体糖蛋白1b连接，介导血小板与损伤部位的细胞外基质进行黏附并生成血小板凝块，起到初级止血作用。
2.放大阶段
初级止血过程中的血小板可为已生成的微量凝血酶提供磷脂表面，进一步促进凝血酶激活血小板和其他凝血因子(包括FⅤ、FⅧ、FⅨ、FⅪ)来扩大凝血级联途径中的酶促反应，即进入放大阶段，以产生大量凝血酶。
3.凝血酶作用阶段
放大阶段可引起凝血酶生成的暴发并进入凝血酶作用阶段。凝血酶可使血浆中的纤维蛋白原转变为纤维蛋白，互相交织的纤维蛋白使血小板凝块与血细胞聚集成血凝块，形成血栓。血小板的突起同时伸入纤维蛋白网内，通过微丝(肌动蛋白)和肌球蛋白的收缩紧实血栓，从而更有效地起到止血作用，即二级止血作用。
上述基于细胞的凝血模型中，血小板为TF和凝血因子之外、参与反应的另一重要成员，其功能可总结为以下两点：一方面，通过形成vWF-血小板-胶原栓子发挥初级止血作用，并为TF-FⅦ a复合物功能的发挥提供磷脂表面；另一方面，为“FⅧ复合物”与“凝血酶原酶复合物”的形成提供磷脂表面，进而通过诱发凝血酶生成的暴发扩大凝血级联反应，生成大量纤维蛋白并形成稳定的血栓。
(三)凝血平衡的维持
凝血平衡的维持依赖于凝血因子与其激活剂/抑制剂间的相互作用和相互制约，还依赖于抗凝系统和纤溶系统功能的正常发挥。适量抗凝蛋白及纤溶蛋白的存在有助于防止凝血酶与纤维蛋白的无限生成，使止血局限于血管破损部位。
1.抗凝系统
抗凝系统蛋白均由肝脏合成，包括蛋白C、蛋白S、蛋白Z、蛋白Z依赖的蛋白酶抑制剂、抗凝血酶(antithrombin，AT)、肝素辅因子Ⅱ(heparin cofactor Ⅱ，HC Ⅱ)及α2巨球蛋白等。凝血酶大量生成后可与凝血酶调节蛋白(thrombomodulin，TM)形成凝血酶-凝血酶调节蛋白复合物(thrombin-thrombomodulin，T-TM)激活蛋白C通路，蛋白C一方面通过灭活FⅤ a及FⅧ a发挥抗凝作用，另一方面通过减少纤溶酶原激活剂抑制剂(plasminogen activator inhibitor，PAI)的产生促进纤溶反应，还可抑制FⅩ与血小板磷脂表面的结合。因此蛋白C同时具有抗凝作用及促纤溶作用。AT属于抗丝氨酸蛋白酶，可通过精氨酸残基与凝血因子(包括凝血酶、FⅩ a、FⅨ a、FⅪ a及FⅫ a)活性中心的丝氨酸残基结合封闭其酶的活性中心而使之失活。肝素是一种酸性黏多糖，主要由肥大细胞和嗜碱性粒细胞产生，存在于大多数组织中，以肝脏、肺脏、心脏及肌组织中更为丰富。肝素在体内及体外均具有抗凝作用，其作用机制在于结合血浆中的一些抗凝蛋白并显著增强其抗凝活性。当肝素与AT Ⅲ结合时，AT Ⅲ与凝血酶的亲和力可增强100倍，加剧了凝血酶的失活。当肝素与HC Ⅱ结合而激活后者时，HC Ⅱ灭活凝血酶的速度可加快约1000倍。蛋白Z是另外一种维生素K依赖的抗凝蛋白，其结构类似于FⅦ、FⅨ、FⅩ及蛋白C，但主要通过与血浆中蛋白Z依赖的蛋白酶抑制剂形成复合物来促进FⅩ a的失活。
2.纤溶系统
在生理止血过程中，当血管创伤愈合后，为了防止机体的高凝倾向，血纤维会被纤溶系统逐级降解。纤维蛋白溶解酶原(纤溶酶原)、纤维蛋白溶解酶(纤溶酶)、纤溶酶原激活剂及纤溶酶原抑制物是纤溶系统的四大组成部分。纤溶酶原及组织型纤溶酶原激活剂(tissue-type plasminogen activator，tPA)的作用尤为重要，二者可同时进入多聚化的纤维素，纤溶酶原通过特异性的赖氨酸结合位点与纤维素及tPA结合，在tPA的作用下，纤溶酶原脱下一段肽链生成纤溶酶，纤溶酶再逐步将整个纤维蛋白或纤维蛋白原分子分割成可溶性小肽，即纤维蛋白降解产物(fibrin degradation products，FDPs)。纤溶系统主要受三种丝氨酸蛋白酶抑制剂调节，包括α2-抗纤溶酶(alpha 2-antiplasmin，α2-PI)、PAI-1及PAI-2。α2-PI由肝脏合成，储存于血小板内，可快速促使游离的纤溶酶失活。PAI-1是tPA及尿激酶型纤溶酶原激活剂(urokinase-type plasminogen activator，uPA)最为重要的快速生理抑制物。PAI-2最早自人类胎盘中分离纯化，对双链tPA与双链uPA具有同等的抑制效应，但对单链uPA的抑制作用较弱。
二、凝血功能紊乱与肝衰竭的疾病进展
肝脏是众多凝血因子、抗凝蛋白及纤溶蛋白的首要合成场所，包括维生素K依赖的蛋白(凝血酶原、FⅦ、FⅨ、FⅩ、蛋白C、蛋白S与蛋白Z)及非维生素K依赖的蛋白(FⅤ、F、纤维蛋白原、AT、α2-PI与纤溶酶原)。肝脏也是凝血因子重要的代谢场所，血液循环中活化的凝血因子、纤溶蛋白及其调节物均可通过肝脏网状内皮系统迅速清除。因此，肝脏在凝血与抗凝血的平衡过程中占据举足轻重的地位，肝脏功能损害可直接导致凝血因子的数量及功能发生异常，依赖于肝脏的止血链亦将受累，且受累程度与肝脏功能损害的严重程度密切相关。
迄今为止，全球尚无明确的肝衰竭分型诊断标准。首先，肝衰竭的病因学较为复杂且区域分布各不相同。乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染所致的乙型重型肝炎在我国占据了相当大的比例，而欧美地区则以药物因素如对乙酰氨基酚引起的急性肝衰竭(acute liver failure，ALF)最为常见。其次，肝衰竭的命名角度不一。欧美国家着眼于肝脏功能的损伤，称之为肝衰竭；而我国则强调肝脏组织的炎性改变，故称之为重型肝炎。其他影响统一诊断标准制定的因素还包括是否将肝性脑病等列为肝衰竭的必备条件、是否排除既往肝病史等。
虽然病原学、命名及入排标准不尽相同，但肝衰竭发生时均伴有严重的肝功能损害，由此继发的凝血功能紊乱也具有共性的机制通路。既往观点认为，由于凝血因子的缺陷，出血是肝衰竭患者凝血功能紊乱的最主要的表现形式。近年来这一理论开始被质疑，越来越多的学者认为，肝功能损害同时影响了肝衰竭患者的促凝系统与抗凝系统，患者凝血系统病理生理学改变的过程应为促凝系统与抗凝系统再平衡的过程，而患者出血的风险系数也应取决于再平衡的结果。多年的临床实践也证明，对肝衰竭患者造成严重威胁的出血事件更多的是与并发的门静脉高压(如静脉曲张性出血)、内皮功能失调、反复感染或肾衰竭相关，而非凝血级联网络的异常。因此，运用“凝血功能紊乱”代替“出血”将更为精准地描述肝衰竭患者凝血系统的状态。肝衰竭相关凝血功能紊乱的发生机制极其复杂，巨噬细胞及其炎症因子fgl2凝血酶原酶所致的肝脏微循环障碍和肝功能损害所致的外周循环凝血功能紊乱均涉足其中，后者又可表现为凝血因子的合成减少、消耗增加(主要为凝血酶原、FⅤ、FⅦ及FⅩ)，活化凝血因子及其与抑制剂复合物的清除率下降、血小板数量和功能异常，以及纤溶作用增强等。弥散性血管内凝血(disseminated intravascular coagulation，DIC)在其中亦发挥一定的作用，但是完全将DIC与肝衰竭所致的凝血功能紊乱区分开较为困难。
(一)巨噬细胞及其炎症因子fgl2凝血酶原酶所致的肝脏微循环障碍与肝衰竭的疾病进展肝衰竭患者肝脏组织病理学的特征性改变包括肝细胞广泛坏死、网状支架塌陷、Kupffer细胞肥大增生及大量炎性细胞浸润等。与此同时，肝脏呈现明显的微循环障碍，光镜下可观察到小叶静脉与坏死区域小血管管壁增厚及均质化，肝窦及血管腔淤血、广泛微小血栓形成等。电镜下主要表现为肝窦内皮细胞窗孔减少、缩小，基底膜形成及狄氏腔内胶原纤维沉积等。
宁琴教授等利用鼠肝炎病毒3型(murinehepatitis virus strain 3，MHV-3)通过腹腔途径感染敏感系BALB/cJ小鼠成功建立了小鼠暴发性肝炎模型(专利授权号：ZL 02 1 15980.7)。对该模型进行系统的研究发现，MHV-3感染后24～48h，BALB/cJ小鼠出现毛发竖立、行走困难、不食等现象，全部小鼠于感染后5～7天死亡。生物化学及肝脏组织病理学检查提示，MHV-3感染后24～72h，小鼠血清谷丙转氨酶(alanine aminotransferase，ALT)与总胆红素(total bilirubin，TBil)水平显著升高；肝脏可观察到类似于人类肝衰竭的组织病理学改变，即局部炎性细胞聚集、纤维素沉积，肝窦微血栓形成及晚期大面积、融合性肝细胞坏死等。研究同时纳入耐受系A/J小鼠，与BALB/cJ小鼠平行感染MHV-3后，A/J小鼠活动自如、饮食正常、全部存活，其肝脏功能及肝脏组织学亦无明显病变。研究者分离BALB/cJ小鼠与A/J小鼠的腹腔巨噬细胞，于体外接受MHV-3攻击后对二者的基因表达谱进行差异分析，克隆到在BALB/cJ小鼠活化巨噬细胞上高表达、与微循环障碍和肝细胞坏死密切相关的新型fgl2凝血酶原酶分子。
fgl2凝血酶原酶属于纤维蛋白原超家族，其C端与纤维蛋白原β、γ亚单位具有36%的同源性。fgl2凝血酶原酶基因全长约7kb，含有2个外显子和1个内含子。将fgl2凝血酶原酶基因的编码序列通过噬菌体/牛痘病毒杂交系统在RAW 264.7细胞中进行表达，其蛋白可表现出明显的促凝活性(procoagulant activity，PCA)。进一步研究发现，fgl2凝血酶原酶具有丝氨酸蛋白酶活性，可绕过经典凝血途径中的FⅩ a，通过产生一个独特的、约24 kD的凝血酶切割片段，直接将凝血酶原裂解成为有活性的凝血酶，从而快速启动凝血过程，催化纤维蛋白原转化为纤维蛋白。定点突变试验表明Ser89为fgl2凝血酶原酶关键的活性位点。类似于FⅩ a，fgl2凝血酶原酶功能的执行也需要Ca2+、磷脂及FⅤ a的辅助，但是其活性的发挥并不依赖于FⅦ，亦不能被AT Ⅲ结合并抑制。
小鼠fgl2凝血酶原酶(mfgl2)基因定位于小鼠第五号染色体。MHV-3感染BALB/cJ小鼠12～24h，从mRNA水平和蛋白水平检测mfgl2凝血酶原酶的表达情况，结果表明，尽管mfgl2 mRNA水平的表达广泛存在于肝脏、脾脏和肺脏，但仅在肝脏Kupffer细胞、血管内皮细胞及坏死、纤维化区域检测到mfgl2蛋白的表达，且其表达水平与肝脏局部纤维蛋白的沉积和肝细胞损伤的严重程度呈正相关。加之平行感染MHV-3的A/J小鼠肝脏中mfgl2凝血酶原酶的表达缺如，提示mfgl2凝血酶原酶在BALB/cJ小鼠肝组织中的特异性高表达可能与小鼠感染MHV-3后暴发性肝炎的疾病进程密切相关。为进一步探讨mfgl2凝血酶原酶在小鼠暴发性肝炎肝损伤中的地位，研究者对MHV-3敏感系小鼠进行了mfgl2凝血酶原酶基因敲除并开展了系列体内外研究。mfgl2基因敲除可显著提高小鼠感染MHV-3后的生存率(40% vs.0)。虽然基因敲除小鼠与野生株小鼠肝组织中MHV-3复制的程度无明显差异，但mfgl2基因敲除小鼠的肝细胞坏死及纤维素沉积明显减少。体外实验亦发现，mfgl2基因敲除小鼠的腹腔巨噬细胞接受MHV-3攻击后其PCA活性未见明显改变，与野生株小鼠巨噬细胞的PCA活性明显增强形成了鲜明对比。
宁琴教授课题组在mfgl2凝血酶原酶的研究基础上进一步成功克隆出人源性fgl2凝血酶原酶分子，即hfgl2凝血酶原酶分子。hfgl2凝血酶原酶基因定位于人第七号染色体，与mfgl2凝血酶原酶分子氨基酸编码序列的同源性超过70%，均编码分子质量为70 kD的蛋白质。为探讨hfgl2凝血酶原酶在乙型肝炎疾病进展中的作用，研究组对乙型重型肝炎与慢性乙型肝炎患者肝组织及外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)中hfgl2凝血酶原酶的表达水平进行了评估。免疫组织化学及原位杂交检测结果表明，23例乙型重型肝炎患者中有21例(91.30%)患者的肝组织特异性高表达hfgl2凝血酶原酶并伴有邻近区域的纤维蛋白沉积，其表达细胞类型主要为肝脏炎性坏死区域浸润的巨噬细胞及肝窦内皮细胞；13例慢性乙型肝炎患者中仅有1例(7.69%)患者的肝组织表达hfgl2凝血酶原酶。30例乙型重型肝炎患者中有28例(93.33%)的PBMC高表达hfgl2凝血酶原酶；10例慢性乙型肝炎患者中仅有1例(10.00%)的PBMC表达hfgl2凝血酶原酶；乙型重型肝炎患者PBMC的PCA活性显著高于慢性乙型肝炎组。正常肝组织及PBMC对照中均未见hfgl2凝血酶原酶的表达。利用MPIAS 500扫描技术对肝组织及PBMC中表达的hfgl2凝血酶原酶进行半定量分析表明，乙型重型肝炎患者hfgl2凝血酶原酶的表达水平与患者血清TBil水平呈正相关。上述研究从肝脏微循环障碍的全新角度切入，提出hfgl2凝血酶原酶介导的免疫凝血是乙型重型肝炎疾病进展、肝细胞坏死的重要分子机制，从而丰富了乙型重型肝炎的免疫学发病机理，hfgl2凝血酶原酶亦可作为有效监测疾病进展的潜在生物学靶标纳入乙型重型肝炎的临床实践。
研究组致力于从病毒蛋白与宿主基因相互作用的角度探讨mfgl2/hfgl2凝血酶原酶特异性高表达的分子机制。对亲代MHV-3、A59型鼠肝炎病毒(murinehepatitis virus strain A59，MHV-A59)、JHM型鼠肝炎病毒(murinehepatitis virus strain JHM，MHV-JHM)、鼠肝炎病毒2型(murinehepatitis virus strain 2，MHV-2)及其子代重组鼠肝炎病毒进行研究发现，诱导小鼠发生暴发性肝炎的MHV-3与MHV-A59病毒的核心蛋白(N蛋白)可激活mfgl2凝血原酶基因的转录。mfgl2基因启动子转录起始位点上游-372位至-306位之间存在激活该基因的调控序列，定点突变候选转录因子的结合位点发现，肝细胞核因子4(hepatocyte nuclear factor 4，HNF4)为N蛋白诱导mfgl2凝血酶原酶基因高表达的必备转录因子。对hfgl2凝血酶原酶的基因调控研究则表明，HBV核心蛋白(HBc蛋白)及X蛋白(HBx蛋白)均具有激活hfgl2凝血酶原酶基因转录的功能。在hfgl2凝血酶原酶基因启动子-712位至-568位之间存在激活该基因的调控序列，c-Ets-2是HBc蛋白及HBx蛋白激活hfgl2基因的必需转录因子，即HBc蛋白和HBx蛋白可分别通过胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)途径和c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)途径激活转录因子c-Ets-2，使其移位至核内并与hfgl2凝血酶原酶基因启动子上的顺式作用元件结合，促进hfgl2凝血酶原酶基因的表达。上述研究提示，除了作为结构蛋白外，病毒蛋白还具有调节宿主基因表达的功能，不仅对深入揭示fgl2凝血酶原酶在重型肝炎中的致病机制具有重要意义，也将为开辟新型分子水平治疗手段提供科学依据。
除了病毒蛋白因素外，近年来，吴玉章教授课题组与宁琴教授课题组合作，应用MHV-3诱导的小鼠暴发性肝炎模型，较为全面地诠释了fgl2凝血酶原酶上游的炎性调控通路。B/T淋巴细胞弱化因子(B and T lymphocyte attenuator，BTLA)是一种共抑制性分子，在维持外周免疫耐受、限制免疫病理损伤中发挥重要作用。与野生株小鼠相比，BTLA基因敲除小鼠感染MHV-3后，肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand，TRIAL)诱导的巨噬细胞凋亡明显增加，肝脏mfgl2凝血酶原酶的表达及纤维蛋白原沉积明显减少，提示了BTLA分子上调mfgl2凝血酶原酶、加剧小鼠病毒性肝炎重症化进程的分子机制。NACHT-LRR-PYD结构域蛋白3(NACHT-LRR-PYD-containing protein-3，NLRP3)炎症小体是由NLRP3、凋亡相关斑点样蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing CARD，ASC)和半胱氨酸蛋白酶1前体蛋白(Pro-Caspase-1)组装成的多蛋白复合体，可将Pro-Caspase-1剪切为有活性的Caspase-1，促进白细胞介素1β(interleukin-1β，IL-1β)、IL-18和IL-33的成熟和分泌，进而介导炎症反应和免疫病理损伤。在MHV-3诱导的小鼠暴发性肝炎模型中，巨噬细胞快速释放的大量活性氧(reactive oxygen species，ROS)可激活NLRP3炎症小体，并通过其下游炎性分子IL-1β诱导mfgl2凝血酶原酶的大量表达，小鼠肝脏炎症反应加剧，死亡率高达100%。补体系统是一组存在于人和脊椎动物正常新鲜血清中的非特异性球蛋白，通过免疫防御、免疫调节及介导免疫病理损伤参与机体的特异性和非特异性免疫应答，是体内重要的效应系统和效应放大系统。研究者首先在乙型重型肝炎患者肝组织样本中观察到hfgl2 凝血酶原酶与C5a受体(complement component 5a receptor，C5aR)伴随高表达的现象，进一步通过MHV-3诱导的暴发性肝炎小鼠模型及体外实验发现，C5a/C5aR可以通过ERK1/2和p38磷酸化信号通路促进巨噬细胞表达fgl2凝血酶原酶，导致肝脏微循环障碍和大面积肝细胞坏死。上述系列研究成果揭示了BTLA、ROS/NLRP3/IL-1β轴及C5a/C5aR是肝脏循环障碍关键致病分子fgl2凝血酶原酶重要的上游调节信号通路，进一步丰富了重型肝炎肝损伤中基于fgl2凝血酶原酶调控的核心分子机制。
(二)肝功能损伤所致的外周循环凝血功能紊乱与肝衰竭的疾病进展
1.肝衰竭时凝血因子的改变
对乙酰氨基酚诱导的ALF患者的血浆凝血酶、FⅤ、FⅦ及FⅩ的含量均明显减少并显著低于FⅨ与FⅪ。FⅦ及FⅤ属于半衰期较短的凝血因子(半衰期分别为4～6h与12h)，其血浆浓度的降低发生较早，凝血酶及FⅩ的含量随即减少。ALF发生时，肝脏巨噬细胞激活并释放高浓度的炎性细胞因子IL-6与肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)，进而引起肝细胞的坏死及TF的合成增加，后者通过激活外源性凝血途径大量消耗FⅦ、FⅩ、FⅤ及凝血酶。凝血酶可被AT结合并抑制，阻止了凝血酶对FⅤ、FⅧ、FⅪ及FⅨ的激活，即阻止了凝血酶诱导的凝血级联放大反应，使得FⅨ、FⅪ的激活与消耗被阻断，保存了后者在血浆中的含量。
部分学者观察了急性病毒性肝炎患者与严重肝性脑病患者体内的FⅤ水平及FⅦ水平，并评估了二者对疾病转归的预测价值。结果表明，当患者体内FⅦ水平低于正常水平的20%时，即使缺乏其他的临床指征，疾病进展为ALF并伴有不良预后(包括死亡及需实施紧急肝移植)的风险系数亦大大提高。较低的FⅤ水平也预示着疾病的迅速恶化，因此入院前3天积极补充FⅤ可有效改善患者的不良预后。肝硬化发生时，虽然患者血浆凝血酶、FⅤ、FⅦ及FⅩ的水平也会下降，但其下降幅度要明显低于ALF患者，可能与肝硬化患者的肝脏炎症反应较弱有关。值得注意的是，肝硬化患者血浆FⅨ亦会降低至同等水平，FⅪ的下降幅度则更为明显。
FⅧ不仅由肝脏合成，还可由肝窦内皮细胞合成。因此，肝脏慢性炎症持续存在的情况下，血浆FⅧ的水平不仅不会降低，反而可能由于肝窦内皮细胞的产生增加而有所升高。FⅧ分解代谢所必需的低密度脂蛋白受体相关蛋白(low density lipoprotein receptor related protein，LRP)亦由肝脏合成，肝衰竭时LRP的合成减少导致FⅧ的清除率下降也是血浆FⅧ水平升高的原因之一。有研究指出，通常血浆FⅧ水平在暴发性肝衰竭中表现为升高，在DIC中表现为降低，但此鉴别诊断方法在临床实践中应用较少。作为一种急性时相反应蛋白，ALF发生时vWF的合成会明显增加，加之vWF-FⅧ复合物的清除率下降，ALF患者的vWF水平及FⅧ水平均不会发生明显下降。
血浆纤维蛋白原也是一种急性时相反应物，肝损害时其含量可保持正常或增加。同时未成熟肝细胞唾液酸转移酶活性的增加可导致60%～70%的纤维蛋白原含有异常的α链及高含量的唾液酸，即属于无功能的纤维蛋白原。因此，常见于慢性病毒性肝炎、胆汁淤积性黄疸及肝细胞肝癌患者的高纤维蛋白原血症，并未增加机体血栓形成的风险。排除遗传因素，低纤维蛋白原血症往往预示着 DIC(消耗增加)或者暴发性肝衰竭(合成减少)的发生。有专家指出，监测纤维蛋白原的水平有助于预测肝病患者的出血风险。来自创伤领域的研究表明，纤维蛋白原水平低于100mg/dL可显著增加非肝硬化患者的出血概率，该数据是否适用于肝衰竭患者尚待深入研究进行论证。
2.肝衰竭时抗凝系统的改变
蛋白C、蛋白S、蛋白Z、蛋白Z依赖的蛋白酶抑制剂和AT、HC Ⅱ及α2巨球蛋白等抗凝蛋白均由肝脏合成，ALF发生时其合成减少，在一定程度上平衡了凝血因子水平的降低。与遗传性蛋白C缺乏症不同，急、慢性肝病中蛋白C的水平通常不会低于正常值的20%。遗传性蛋白C缺乏可发生于20%的Budd-Chiari综合征(Budd-Chiari syndrome，BCS)患者，在一般人群及门静脉血栓患者中较为少见。重型肝炎发病时，肝脏合成障碍会导致蛋白C水平的急剧下降，此时若能检测到正常水平的FⅡ及蛋白C/FⅦ值，则有助于证实遗传性蛋白C缺乏的共存状态。遗传性蛋白S缺乏较为罕见，尤其在亚洲地区，可发生于7%的BCS患者或门静脉血栓患者。
AT是由肝脏及内皮细胞合成的非维生素K依赖的糖蛋白，可抑制凝血酶诱导的凝血级联放大反应，也可直接抑制凝血酶、FⅩa、FⅨa、FⅪ a及FⅫ a。ALF患者的血浆AT水平显著下降，而T-AT复合物含量的明显升高在一定程度上解释了功能性AT减少的现象，也支持AT可通过结合凝血酶来阻断FⅨ、FⅪ的激活与消耗。
3.肝衰竭时纤溶系统的改变
除了tPA与PAI-1外，纤溶系统的其他蛋白均在肝脏合成，因此，肝病发生时常伴有纤溶酶原及其抑制剂α2-PI、TAFI及F水平的大幅度降低。慢性肝病中，由于激活的内皮细胞释放增加和(或)肝损害导致的清除率下降，血浆tPA的水平会有所增加，而其抑制剂PAI-1的水平正常或仅轻度升高，不足以平衡tPA增加的幅度，机体可表现为纤溶亢进。但在ALF发生时，作为急性时相反应物的PAI-1，其水平可大幅度上升，从而对tPA增加引起的纤溶亢进发挥一定的逆转作用。TAFI是由肝脏合成的前羧基肽酶，对纤溶反应具有重要的调节作用，经过凝血酶或纤溶酶激活后，TAFI可转变为活性产物TAFIa。当纤溶酶原通过特异性的赖氨酸结合位点与纤维蛋白及tPA形成三聚体后，TAFIa通过移去纤维蛋白C端的赖氨酸来阻止纤维蛋白对tPA激活纤溶酶原的辅助作用，最终纤溶酶含量下降，纤溶过程被抑制。因此，虽然ALF患者体内存在明显的纤溶系统异常，但是由于大量抑制性因素的存在，纤溶亢进引起的出血并不多见。
4.肝衰竭时血小板数量及功能的改变
血小板数量及功能异常在肝病中极为常见，是导致凝血功能紊乱的重要因素之一。临床上急、慢性肝衰竭患者均会伴有轻度到中度的血小板减少。慢性肝病尤其是伴有门静脉高压的患者，脾脏功能亢进可导致大量血小板在脾脏淤滞破坏。其他血小板减少症的发病机制还包括肝损害时肝脏合成血小板生成素(thrombopoietin，TPO)减少、血小板相关免疫球蛋白(platelet associated immunoglobulin，PAIgG)介导的血小板免疫损伤、DIC低凝期血小板消耗增多等。在酒精性肝病中，叶酸的缺乏以及酒精对巨核细胞的毒副作用还可导致缺陷血小板的生成。大部分TPO由肝细胞专职产生，极少部分由肾脏、骨髓基质细胞及肌肉合成，对骨髓生成血小板具有潜在的促进作用。正常肝脏组织中，TPO的生成量恒定且不会在转录水平受到影响，但严重肝病发生时，TPO的水平会显著下降。
血小板悬浮状态下聚集能力受损在急、慢性肝衰竭患者中也较为常见。其具体机制涉及获得性储备池缺陷、跨膜信号转导途径缺陷、膜上血栓素A2合成所必需的花生四烯酸水平降低、纤溶酶蛋白水解作用导致功能性血小板受体水平下降等。此外，异常高密度脂蛋白的出现、下降的血细胞比容也可损伤血小板的功能。内皮细胞来源的一氧化氮(NO)及前列环素均为重要的血小板抑制剂，二者水平的增加也能将血小板锁定在失活状态。
血小板数量及功能发生异常后，血浆vWF水平会代偿性升高，后者是血小板在损伤部位初始黏附的关键蛋白。对健康志愿者的研究表明，血浆高水平的vWF有助于流动状态下血小板的黏附，可在一定程度上代偿血小板的数量减少和功能下降。
5.肝衰竭时DIC的发生
DIC的发生概率及严重程度与肝病的进展阶段密切相关，其发生机理可涉及多种因素，包括肝细胞坏死后释放大量组织凝血活酶样物质进入血循环启动凝血级联途径、单核-巨噬细胞系统功能损害致活化凝血因子的清除障碍、抗凝物质的合成减少以及内毒素进入门静脉循环等(图5-9)。DIC低凝期多见于终末期肝病(end-stage liver disease，ESLD)患者，10%以上的ALF患者可出现DIC，一旦发生预后凶险，临床表现为全身出血倾向，尤其是皮下出血、消化道出血、血尿及鼻衄等，其中消化道出血发生率可达35%以上。凝血指标变化可特征性表现为血小板减少、PT及活化部分凝血活酶时间(activated partial thromboplastin time，APTT)延长、纤维蛋白原水平下降，FDPs含量增加等。此外，凝血酶原片段F1+2、血纤维蛋白肽A、D-二聚体及T-AT复合物的水平也呈现不同幅度的增加。因与疾病本身引起的凝血功能紊乱极其相似，临床上慢性肝病患者及ESLD患者DIC的确诊较为困难。相对而言，增加的D-二聚体水平可同时反映凝血系统与纤溶系统的激活，通常被认为是诊断DIC的特异性指标。系列实验室检查结果亦表明，FⅧ及纤维蛋白原水平下降并伴有D-二聚体水平的增加是DIC患者较为常见的特征，高水平的FDPs或者大量功能失活的纤维蛋白原则主要见于ESLD相关的凝血功能紊乱。临床上确证的DIC在单纯性肝病患者中并不常见，如若发生，患者可能伴有严重的细菌感染或败血症，亦可见于腹腔静脉分流的患者。
三、基于凝血与抗凝血反应的肝衰竭干预策略及潜在干预靶点
随着临床及实验室研究证据的增加，我们逐渐认识到，肝损伤可以引起促凝因子和抗凝因子水平的平行下降，也可以引起vWF及FⅧ水平的增加，机体凝血系统的再平衡机制及再平衡的不稳定性决定了患者可能兼具出血与血栓形成的风险。现有治疗肝病患者凝血功能紊乱的策略多侧重于改善其外周出血倾向，针对肝脏区域微循环障碍的干预鲜见报道。下文将从肝脏及外周循环两个方面出发，着重探讨现有基于凝血与抗凝血反应、针对肝衰竭患者较为成熟的干预策略及潜在的干预靶点，可望为相关临床治疗方案的实施提供基础和依据。
(一)肝脏微循环障碍的干预
宁琴教授等以肝脏微循环障碍作为切入点，系统阐明了fgl2凝血酶原酶在MHV-3诱导的小鼠暴发性肝炎及乙型重型肝炎发生发展中的重要作用及其分子调控机制，首次提出fgl2凝血酶原酶所致的免疫凝血途径可直接引发肝脏纤维蛋白沉积及微循环障碍，最终导致肝细胞缺血缺氧至坏死，从而对肝衰竭肝细胞坏死的分子机制提出了全新的见解。研究者进一步对fgl2凝血酶原酶这一关键炎性基因进行靶向干预，探讨其在肝衰竭治疗中的潜在应用前景。课题组首先构建了与mfgl2凝血酶原酶基因外显子Ⅰ序列(包括翻译起始位点)互补的反义RNA质粒，将其与对照质粒共同转染至小鼠RAW 264.7巨噬细胞系，并在培养体系中加入可诱导mfgl2凝血酶原酶基因高表达的细胞因子IFN-γ。实时荧光定量PCR技术(real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-PCR)和Western blotting技术检测到mfgl2反义RNA可明显抑制mfgl2凝血酶原酶的表达，并显著降低细胞的PCA活性。体内研究中，通过尾静脉高压注射将mfgl2反义RNA导入MHV-3诱导的暴发性肝炎小鼠肝脏，可使小鼠的生存率由0提高至33.3%。MHV-3感染后48～60h，接受mfgl2反义RNA治疗的小鼠的ALT水平显著下降，肝脏炎性细胞浸润、肝细胞坏死及纤维蛋白沉积亦明显减少。在特异性反义RNA干扰的基础上，课题组进一步构建了针对mfgl2凝血酶原酶分子的短发夹状双链RNA(RNA dual shorthairpin，shRNA)干扰质粒和重组腺病毒载体包装的微小RNA(microRNA，miRNA)干扰质粒，并以介导肝细胞坏死及凋亡的重要分子TNF受体1(TNF receptor 1，TNFR1)和Fas(又称为CD95)作为联合干预靶点开展基因治疗工作。研究结果表明，以fgl2凝血酶原酶为基础、联合干预其他炎症因子的基因治疗策略可显著提高MHV-3诱导的暴发性肝炎小鼠的生存率(由0提高至33.3%～44.4%)并延长存活时间。干预小鼠肝脏mfgl2凝血酶原酶的表达、纤维蛋白原沉积、肝细胞坏死及凋亡均明显减少，肝功能及肝脏组织炎性损伤亦明显缓解。上述研究结果不仅验证了fgl2免疫凝血在重型肝炎发生发展中的重要地位，亦提示以fgl2凝血酶原酶为主要靶点开展基因治疗，可有效纠正肝脏微循环障碍，对控制肝衰竭的疾病进展、治疗原发病或延缓合并症不无裨益。基于此，fgl2凝血酶原酶作为监测乙型重型肝炎疾病进展的重要生物学标志物及有效干预靶点被纳入亚太肝衰竭防治共识。
前已述及，BTLA分子、ROS/NLRP3/IL-1β轴及C5a/C5aR通路对fgl2介导的免疫凝血具有激活及正向调控作用，研究者进一步在MHV-3诱导的小鼠暴发性肝炎模型中对上述重要免疫分子进行基因敲除或免疫拮抗，结果表明可显著降低肝脏fgl2凝血酶原酶的表达并减轻肝脏组织的炎性病理损伤，小鼠生存率亦得以明显提高(BTLA分子，提高88%；ROS/NLRP3/IL-1β轴，提高25～60%；C5a/C5aR通路，提高70%)。该研究拓展了fgl2免疫凝血上游炎性调控因素在重型肝炎发病机制中的作用，相关免疫分子亦有望成为潜在的干预靶标，通过缓解肝脏微循环障碍而最终发挥对肝衰竭的保护作用。
(二)外周循环凝血功能紊乱的干预
1.维生素K
作为一种脂溶性维生素，维生素K参与了部分凝血因子(如凝血酶原、FⅦ、FⅨ与FⅩ)及抗凝蛋白(如蛋白C、蛋白S与蛋白Z)的合成。所有维生素K依赖的凝血因子的氨基端均具有尚待完成γ-羧基化的谷氨酸残基，后者对凝血因子通过Ca2+连接到磷脂表面并最终形成凝血因子复合物至关重要。维生素K是谷氨酸γ-羧基化反应的重要辅因子，因此维生素K的缺乏或其拮抗物的存在可直接导致相关凝血因子的合成障碍，取而代之产生系列无活性的凝血因子前体蛋白。目前国际上已将凝血酶原前体蛋白(PIVKA Ⅱ)的水平作为反映机体维生素K营养状况最为敏感的指标。Shearer等认为，外周血PIVKA Ⅱ的异常可与维生素K的缺乏同步出现，并早于常规凝血指标的变化，通过检测PIVKA Ⅱ评估维生素K的水平要比PT测定敏感1000倍。在临床实践中，约有25%的ALF患者会发生亚临床的维生素K不足，然而，鉴于严重的肝脏实质性病变可直接导致凝血因子的合成减少，补充维生素K对纠正肝衰竭凝血功能紊乱的疗效十分有限。
2.血浆
直接从全血中提取的新鲜冰冻血浆(fresh frozen plasma，FFP)包含了vWF之外的所有凝血因子。近年来的一项调查发现，每1000例ALF患者中超过90%在入院第一周内输注了平均14 U的FFP。预防性输注FFP是否可以确切改善ALF患者的凝血功能紊乱，或明显降低拟植入介入性装置(如行肝脏穿刺检查)患者的出血风险尚存在争议，FFP输注的有效性和安全性亦缺乏大样本、随机对照研究予以支持。Grant A等在肝脏穿刺临床实践指南中指出，如果患者PT的延长时间介于4~6s之间，输注FFP可使其PT缩短至理想的范围。近来一项模拟体内FFP输注剂量(15mL/kg)的体外研究则表明，虽然FFP输注缩短了慢性肝病患者延长的PT，但并不能改善其凝血酶的生成状况。临床实践中也很难实现完全纠正患者PT与INR并避免FFP输注过量的双赢局面，而过量的FFP会引起门静脉高压和颅内高压的恶化，进一步增加患者的出血风险。其他FFP输注的不良反应还包括血源性传染性疾病、输注相关的急性肺损伤、过敏性发热或溶血反应等。因此，相当一部分学者主张最大限度地避免预防性或以纠正INR为目标的FFP输注，有针对性的凝血因子补充才是患者更为理想的选择。
3.冷沉淀
冷沉淀由FFP制备而来，为富含FⅧ、vWF、纤维蛋白原、纤维粘连蛋白及F的血浆衍生物。每份冷沉淀包含80～100 IU/mL的FⅧ及至少140mg的纤维蛋白原，通常用于治疗具有严重凝血功能障碍、低纤维蛋白原血症或无功能纤维蛋白原血症的患者。尽管目前尚缺乏大样本、前瞻性队列研究的验证，对于具有活动性或难以控制的出血的患者，研究者仍然推荐应通过冷沉淀治疗将其纤维蛋白原水平提高至120mg/dL。
4.去氨基-8-右旋-精氨酸加压素
去氨基-8-右旋-精氨酸加压素(简称去氨加压素或DDAVP)是人工合成的血管加压素同系物，可有效提高FⅧ及vWF的血浆浓度，并增强血小板对血管壁的黏附功能。DDAVP可用于需要植入介入性装置的肝硬化患者，以缩短或纠正其延长的出血时间。然而，已有两个随机入组的临床研究结果显示，DDAVP并不能减少实施肝脏切除术患者的术中出血及其对输血的需求，亦不能减少肝硬化患者急性静脉曲张性出血的发生。
5.血小板
血小板输注通常用于具有活动性出血、血小板计数低于50000/μL或已知既往具有血小板功能失调病史的肝病患者。对于血小板计数低于50000/μL且拟植入介入性装置(如实施经皮肝脏穿刺)的患者，预防性的血小板输注是临床上采取的必要治疗措施。输注后1h的血小板计数通常用于评价血小板输注的疗效并指导后续的治疗策略。由于对血小板截留破坏的增加，具有明显脾大的患者在实施血小板输注后其血小板数量并不能得到有效恢复。其他血小板输注疗效不佳的情况还可见于DIC患者，血小板特异性抗体和(或)人类白细胞抗原(human leukocyte antigen，HLA)抗体导致严重感染与异源性免疫反应的患者。血小板生成素(TPO)是一个具有相对谱系特异性的细胞因子，体外可促进巨核细胞的生长与成熟，体内亦可间接提高血浆血小板的水平，对治疗肝病患者血小板减少所致的出血仍然具有一定的应用价值。
6.抗纤溶药物
ε-氨基己酸、氨甲环酸及抑肽酶等均属于抗纤溶药物，可通过抑制纤溶酶的产生来减少慢性肝病中纤溶亢进所致的出血以及肝脏移植的术中出血。最新Meta分析研究亦提示，除非机体本身预先处于高凝状态，抗纤溶药物的应用并未增加患者的血栓形成风险，但DIC患者是此类药物应用的禁忌对象。
7.重组FⅦ a
重组FⅦ a(recombinant FⅦ a，rFⅦ a)为基因工程产品，其氨基酸序列及结构修饰与人类血浆来源的FⅦ a极其相似。rFⅦ a通过与细胞表面的TF形成复合物，诱导活化血小板产生凝血酶，激活TAFI通路抑制纤溶作用，增强循环中血小板的黏附和聚集功能，从而促进止血，形成稳定的纤维素性血凝块。目前rFⅦ a已被批准应用于治疗存在FⅧ抑制物的患者、实施肝脏切除术的患者以及改善食管静脉曲张性出血等。部分研究表明，与FFP输注相比，rFⅦ a具有明显改善INR且不增加血容量的优势，但也有用药后并发血栓形成的病例报道。因此，rFⅦ a须谨慎应用于DIC、冠状动脉疾病、严重脓毒血症等具有较高血栓形成风险的患者，rFⅦ a在肝病患者中应用的最佳剂量及其安全性与有效性的评价也需开展深入研究。
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