肠道微生态与乙型肝炎重症化
李兰娟
我国是世界上病毒性肝炎的高发区，HBV携带者近1亿。虽然一些抗病毒药物在临床上得到了广泛应用，但是慢性肝炎进展为肝硬化、重型肝炎的势头仍未得到有效遏制。目前随着人工肝和肝移植技术的不断发展，终末期肝病的病死率有所下降，但由于经济、技术等各种条件的限制，慢性肝病总体病死率仍居高不下。
临床研究显示肝病的发生、发展与人体微生态的变化密切相关。其中肠道微生态与肝脏在解剖结构上和功能上都有着密切的联系。无菌和悉生动物研究发现肠道细菌及内毒素对肝脏Kupffer细胞数量的增加及功能的完善起重要的作用。正常情况下，肝脏可清除来自肠道的包括内毒素、氨、吲哚、酚类、短链脂肪酸、假性神经递质前体等各种毒素，还能清除肠源性细菌、真菌等。一旦肝脏功能受到严重损伤，肠道微生态可发生显著变化，进而肠道屏障功能受损，肠道细菌及其各种代谢产物大量移位进入肠外器官，过度激活机体免疫系统，引起异常免疫反应，导致肝细胞凋亡、坏死。这大大加快了乙型肝炎重症化、肝硬化并发上消化道出血、肝肾综合征及感染的进程。反之，内毒素血症、胃肠功能不全等又可通过肠道微生态的变化加重肝损害，形成恶性循环。在这种背景下，国内外许多专家致力于这方面的研究，现将近年来的进展做简要介绍。
一、肠道微生态基础
人类是由人体细胞和微生物细胞共同组成的超生物体，微生物细胞总数相当于人体细胞数的10倍，其中肠道微生物是人体最庞大而复杂的微生态系统，从消化、营养吸收、能量供应、脂肪代谢、免疫调节、抗病等诸多方面影响人体的健康。
(一)胃肠道微生态系统
生态学是研究生物与生物、生物与环境相互依赖和相互制约的科学。在近100年的历程中，生态学已发展成了一个庞大的学科，拥有一百多个分科。1977年，德国Volker Rush博士首先明确提出“微生态学”这个词，在德国建立起第一个微生态研究所，并于1985年提出一个新的定义：微生态学是细胞水平或分子水平的生态学。我国康白教授在此基础上加以深化认识，提出了微生态学是研究正常微生物群与其宿主相互关系的生命科学分支。人体的生态系统主要包括口腔微生态区系、上呼吸道微生态区系、皮肤微生态区系、泌尿生殖道微生态区系和胃肠道微生态系统。
胃肠道微生态系统是人体最大的微生态系统，含有人体最大的储菌库及内毒素池。胃肠道微生态系统菌种达500余种，质量约1000g，接近肝脏的质量。据研究，胃内含菌量小于103CFU/mL，主要为需氧革兰阳性链球菌、葡萄球菌、乳酸杆菌及一些酵母菌。近端小肠含菌量在103～104 CFU/mL，除了主要的链球菌、葡萄球菌和乳酸杆菌外，还可分离出韦荣球菌、放线菌、肠杆菌，而厌氧菌较少。远端小肠含菌量在106～108CFU/mL，革兰阴性菌数量超过革兰阳性菌，肠杆菌明显增多，类杆菌、双歧杆菌、梭杆菌达一定水平。大肠中细菌含量则明显增多，达1011～1012CFU/g(肠内容物)，以类杆菌、双歧杆菌、消化链球菌、真杆菌为主，梭菌、乳酸杆菌、肠杆菌、肠球菌含量较低(小于108CFU/g肠内容物)。粪便含菌量分类情况则与大肠接近。正常菌群可产生短链脂肪酸、次级胆汁酸、吲哚及其衍生物、内毒素(脂多糖)、三甲胺等一系列菌群代谢产物和衍生物，影响宿主能量稳态、食欲、血糖、炎症和内分泌代谢等，调控宿主营养、代谢和免疫。例如，肠道细菌可产生B族维生素和维生素K，对人体具有营养作用；产生短链脂肪酸(C2～C4)，通过肝脏的代谢作用，为人体提供能量；还可产生酶类物质，如β葡萄糖醛酸酶、硫化酶等，对胆红素、胆汁酸、胆固醇、雌激素等的肠肝循环起重要作用。
正常情况下，肠道微生态处于平衡状态。一方面，正常菌群中的专性厌氧菌(如双歧杆菌)通过磷壁酸黏附作用占据于肠上皮细胞表面，形成一层菌膜屏障，抑制肠道内源性及外源性潜在致病菌(potentially pathogenic microorganisms，PPMOs)对肠上皮细胞的黏附、定植。另一方面，肠道内双歧杆菌、乳酸杆菌等生理有益菌通过定植抗力机制对肠道内细菌如大肠杆菌、铜绿假单胞菌、沙门菌、链球菌等起抑菌或杀菌作用，抑制肠道PPMOs生长。此外，肝脏产生的胆汁可抑制肠道内细菌(主要是革兰阳性菌如肠球菌等)的生长，对维持肠道生态平衡起调节作用，胆盐还可与肠道内毒素结合，抑制内毒素移位。在某些病理情况(如重型肝炎、肝硬化、严重烧伤、小肠移植等)下均可以出现肠道菌群失调、肠壁屏障功能损伤、细菌移位及肠源性内毒素血症。另外一些药物如制酸剂、抗生素也能造成肠道菌群的失调。
(二)胃肠道微生态系统的影响因素
胃肠道的种群水平和演替过程受宿主影响的因素很多，包括宿主基因、围生期因素(分娩、喂养方式等)、饮食、抗生素使用、益生菌制剂、手术、压力、疾病等。
科学界一直认为胎儿在母体内处于无菌环境，近期研究表明，人体初始菌群定植可能发生在出生前，胎儿肠道内可能存在有限的细菌，如微球菌。出生后，肠道菌群在前3年内迅速变化。出生时胎龄和分娩方式对肠道菌群产生影响，可以持续到4岁，例如，母乳喂养婴儿中占优势的是双歧杆菌。种族因素也影响婴儿肠道菌群的早期发育。在摄入各种食物后，肠道内形成不同的细菌，有超过50属400多种细菌定植，上端消化道内很少有细菌，大多数细菌定植在下消化道，大部分为专性厌氧菌，如类杆菌、双歧杆菌、乳酸杆菌和真杆菌等。这些细菌可产生结肠细胞所必需的各种维生素和营养物质，帮助消化各种营养物质，防止宿主被有害菌侵袭及刺激免疫系统。
胃肠道系统本身存在多种因素影响菌群结构。①胃酸能调节胃内微生物群落，将大部分来自口腔、呼吸道及食物的微生物有选择地抑制和杀灭，胃酸的多少或有无还对胃内、近端小肠的微生物群落有影响。②挥发性或非挥发性的短链脂肪酸是专性厌氧菌的代谢产物，可抑制外籍菌的需氧菌或兼性厌氧菌。③胆汁酸可以维持肠道菌群稳态，防止细菌移位，还可以驱动新生儿肠道菌群的成熟。在肝病患者中，胆汁酸分泌异常常导致小肠上部细菌过生长综合征，结合胆汁酸对定植于小肠菌群组成的影响主要是对外籍菌的抑制。④宿主肠道非特异性免疫系统在调节肠道菌群中具有重要作用，在普通动物的肠黏膜的基底层内存在大量巨噬细胞与多形核白细胞，发挥强大的吞噬作用。⑤细菌本身也可以产生细菌素。
饮食和药物是影响胃肠道微生态系统的关键因素。不同食物类型对肠道微生物群影响不同，植物为主的食物如水果、蔬菜、不可消化碳水化合物等可调节肠道菌群丰度和结构，促进宿主健康。如，富含全谷物和麦麸的饮食与双歧杆菌和乳酸杆菌的增加有关。蛋白质和油脂，对肠道菌群的调节以及对健康的影响依赖于其类型和数量。发酵类食品可短暂改善肠道菌群，而食品添加剂或可降低菌群多样性，诱导炎症和代谢变化。此外，药物特别是抗生素的使用，对胃肠道菌群产生深远影响。生命不同阶段(儿童期和成年期)使用抗生素对肠道菌群的短期和长期影响存在差异，与菌群的成熟度、环境、疾病状况(如炎症疾病)等有关。
小肠蠕动速度可直接影响上部消化道的微生物群落的定性和定量结构。肠蠕动缓慢不仅可以导致小肠上部细菌过生长综合征，而且可以引起局部感染。肠蠕动无力或小肠清除内容物不力都可促进细菌过生长综合征的发生。如，小肠憩室及外科手术造成的盲袢综合征、小肠部分梗阻等，均可引起细菌过生长综合征。具有全身性疾病或解剖学异常的老年人也可发生细菌过生长综合征。此外，萎缩性胃炎、外科手术或药物(制酸剂)治疗都可以引起小肠细菌过生长综合征。
(三)无菌动物的研究作用
1965年，Schandler等研究者首次将细菌移植给无菌小鼠，揭示了肠道菌群对宿主发育及生理功能的重要性，建立了利用无菌动物研究肠道菌群对宿主作用的新方法。无菌动物及悉生动物研究同样发现人类的免疫、生化指标等均与正常菌群特别是肠道菌群密切相关。
无菌动物是指现有检测手段不能检出任何活的微生物和寄生虫的动物。通常实验动物的体内和体外带有寄生虫，体内还常带有细菌和病毒，而且难以排除某些潜在的传染病。普通实验动物体内菌群关系复杂，且血清中含有抗体，用普通动物进行医学科学研究，将会存在各种各样的干扰。无菌动物是在无菌屏障系统中，剖腹取出胎儿，饲养繁育在无菌隔离器中，饲料、饮水经过消毒，定期检验，证明动物体内外均无一切微生物(包括大部分病毒)和寄生虫的动物。无菌动物的“菌”主要是指细菌，严格来说，还包括真菌、立克次体、支原体和病毒等微生物及各种寄生虫。所谓“无”却不是绝对的，不过是根据现有的科学知识和检查方法在一定时期内不能检出已知的微生物和寄生虫而已。到目前为止，尚未确立无菌动物的微生物检定方法，研究者的检定方法各式各样，其中病毒和立克次体的检查尚有相当多的问题。例如，实验室使用最多的无菌小鼠，用电子显微镜检查证明，胸腺细胞中仍存在白血病病毒，因而，现在的所谓无菌动物，是指动物体内和体外未能检出细菌、真菌、寄生虫的动物。
无菌动物不携带其他生命体，无外来抗原的刺激，免疫系统处于“休眠状态”，是研究免疫发生、发展机制的理想动物。无菌动物可用于研究微生物与微生物的共生与拮抗之间的相互关系，以及微生物与宿主的相互作用，即微生物与宏生物相互关系。近年来，无菌动物在代谢、炎症性疾病与脑肠轴等研究中的应用日益增加，但也发现无菌动物与SPF级动物和人类仍有区别，如无菌动物盲肠扩大、小肠发育差等，研究结果并不能直接推演至人类。尽管如此，无菌动物运用于菌群研究可以推动因果性研究的发展，提供相对可靠的因果性研究证据。
(四)微生态与肠道屏障功能
肠道屏障系统主要包括肠道正常菌群、黏液层、肠上皮细胞层、紧密连接和肠道免疫系统等。肠道中的专性厌氧菌如双歧杆菌等通过与肠上皮细胞密切接触，占据肠上皮细胞表面的空间位置，构成菌膜屏障，抑制肠道内潜在致病菌对肠上皮细胞的黏附与繁殖。另外，肠道内双歧杆菌、乳酸杆菌等益生菌还具有多种生物拮抗功能，如通过营养争夺、产生各种有机酸降低肠道局部pH以及产生具有广谱抗菌作用的物质(如防御素、细菌素、过氧化氢、抗菌肽及亲脂分子等)，对肠道内的潜在致病菌起抑制或杀灭作用；激活淋巴细胞，增加抗体产生，促进细胞因子分泌，增强免疫系统对恶变细胞的识别能力和抗感染能力；刺激干扰素的产生，促进肠道内sIgA和其他免疫球蛋白分泌，增加肠道局部免疫力等；抑制毒素和受体相互作用，间接起到抗致病菌定植作用。肠黏液层主要包括肠杯状细胞分泌的黏蛋白及肠淋巴细胞分泌的sIgA，肠黏液层一方面为专性厌氧菌提供良好的生态环境，可促进其生长，另一方面黏蛋白可与肠上皮细胞的细菌结合位点竞争，以阻止细菌与肠上皮细胞的结合，使细菌处于黏液层，利于其被肠蠕动所清除。肠上皮细胞通过物理和化学屏障隔离肠道菌群和宿主免疫细胞，避免过度免疫反应，维持共生关系。肠道免疫系统又称肠道相关淋巴组织(gut-associated lymphoid tissue，GALT)，包括上皮细胞、固有层淋巴细胞、淋巴滤泡、肠系膜淋巴结等，可以直接或间接影响肠道菌群，通过免疫反应调整肠道菌群组成、多样性和转移。
二、乙型重型肝炎感染微生态
肝脏与胃肠道的解剖关系甚为密切，共同组成消化系统整体。在病理状态下，消化系统各器官之间常相互影响，或互为因果。在100多年前，巴甫洛夫等发现，结扎门静脉后，实验动物可出现发热、肾炎等，他们认为这与肝脏不能清除来自肠道的毒素有关。肝病时患者常伴有胃肠道症状，如食欲下降、恶心、呕吐等胃肠表现。肝硬化、乙型重型肝炎患者易发生胃肠道微生态紊乱或胃肠道感染，出现腹泻、便秘等症状，甚至消化道出血等。胃肠道病变又可加剧肝病的病情，形成恶性循环。
(一)肝病中的肠道微生态
严重疾病、抗生素和制酸剂的应用等均可对肠道微生态产生严重影响，导致肠道微生态失调。肝病状态下，尤其在肝硬化或乙型重型肝炎时，患者消化道症状明显，如恶心、呕吐、食欲减退等，造成患者饮食摄入减少，肠道菌群营养底物相对不足；肝功能不全，肝脏合成功能下降，血浆中的白蛋白急剧下降，易发生组织器官水肿和腹水；胆汁分泌不足，肠道内胆盐缺乏；肝脏结构改变，门静脉高压形成，导致胃肠道淤血和缺氧，出现门静脉高压性胃病及肠病；由于肝脏合成凝血因子减少，加上胃肠道淤血，临床上为防止上消化道出血，常预防性或治疗性应用制酸剂如奥美拉唑等，这些因素均可导致肠道微生态失调。
动物实验表明急性肝衰竭大鼠的胃、空肠、回肠内存在结肠型细菌，并有细菌过度生长、肠管扩张、肠壁变薄等肠道微生态失调的表现。这种失调出现于整个肠道，主要表现为肠杆菌科细菌的过度生长和乳酸杆菌的减少；肠道菌群失调时伴随有肠道内毒素的增加，并导致门静脉中内毒素增加；肠道菌群恢复时门静脉中内毒素可以减少，但是大鼠肠道内毒素的减少要晚于肠道菌群的恢复；肠道菌群失调程度随肝功能损害加重而加重，并随肝功能好转而恢复。
对慢性重型肝炎患者粪便菌群进行定性和定量分析也发现，慢性重型肝炎患者肠道双歧杆菌、类杆菌等专性厌氧菌显著减少，而肠杆菌科细菌、肠球菌、酵母菌等兼性厌氧菌显著增加，存在肠道微生态失调。肠道微生态失调程度与肝病的严重程度相关。双歧杆菌/肠杆菌值在慢性乙型肝炎中明显下降，可以反映肝病进程中肠道微生态的失调程度。肝硬化患者肠道菌群分析研究也发现了类似的情况，肠道菌群失调程度与肝硬化分级有一定相关性，肠道微生态失调在Child-Pugh分级C级患者中表现得最为明显。
最近，研究人员运用基于16S rDNA的高通量测序技术和定量PCR技术对36例肝硬化患者粪便菌群结构进行分析发现，UniFrac PCA显示肝硬化患者粪便菌群结构与正常人群存在显著差异。肝硬化患者肠道菌群中类杆菌门细菌的比例明显下降，而变形菌门和梭杆菌门细菌的比例显著增加。肝硬化患者肠道菌群中肠杆菌科、韦荣球菌科和链球菌科细菌明显增加，其中链球菌科细菌的比例与肝硬化Child-Pugh评分成正比，且随肝硬化病情加重而显著增加。研究结果证实，肝硬化患者肠道菌群中潜在致病菌(如肠杆菌科细菌及链球菌科细菌等)比例明显增加，并与肝硬化Child-Pugh评分呈正相关。同时发现患者肠道毛螺菌比例明显降低，并与肝硬化病情程度呈负相关，或可将其作为有益菌进行进一步研究。
(二)肠道微生态变化与乙型重型肝炎的关系
慢性重型肝炎是我国慢性肝病患者死亡的重要影响因素之一。重型肝炎发病机制复杂，除与病毒变异(我国主要为HBV)以及合并其他类型的肝炎病毒感染如HCV、HDV、HEV等感染外，复杂的内毒素/细胞因子网络在其中发挥重要作用。研究表明慢性肝炎、慢性重型肝炎患者存在肠道微生态失调，失调程度与肝病严重程度有关。肠道微生态失调、肠道定植抗力下降及肠道屏障功能受损是肠道内毒素移位、内毒素血症形成的原因之一。内毒素及由内毒素刺激机体产生的TNF-α、IL-1等细胞因子可引起肝细胞凋亡、坏死，加重肝脏原有的损伤，是导致慢性肝炎重症化的重要原因之一。
(三)肠道微生态失调与肝病并发症
肝硬化失代偿期和重型肝炎患者可出现各种并发症，其中与肠道微生态有明显关系的有继发性感染(如自发性细菌性腹膜炎、肺炎、败血症等)、内毒素血症、肝性脑病、上消化道出血、肝肾综合征等。慢性肝病患者一旦出现并发症，则预后极差，有些并发症可以是直接导致病死的原因。因此，在治疗肝病时，尚需从肠道微生态的角度预防和治疗肝病并发症。
(四)继发感染
慢性肝病，尤其是肝硬化失代偿期及慢性重型肝炎患者，容易发生继发感染，感染原因与肝脏清除肠道源性微生物、内毒素等有害物质功能下降，机体免疫力减退，中性粒细胞功能异常，血清补体、纤维连接蛋白、调理素水平等低下，治疗过程中侵入性诊疗操作的增加有关。肠道菌群失调，肠杆菌科细菌、真菌过度生长，肠道屏障功能不全或衰竭，肠道细菌移位等在肝病继发感染中也起着非常重要的作用。继发感染的病原菌以肠道细菌为主，如大肠杆菌、沙门氏菌、肺炎杆菌、弯形杆菌、铜绿假单胞菌等。继发感染的常见类型有自发性腹膜炎(SBP)、胆道感染、肠道感染、肺部感染、尿路感染等。抗生素治疗虽然可以控制感染，但长期大剂量使用也使得细菌耐药现象不断增加。现在临床上已经出现的有耐甲氧西林的葡萄球菌、产ESBL的革兰阴性大肠杆菌和耐万古霉素的肠球菌。这些耐药菌的出现使临床医师再次面临治疗感染的难题。抗生素在杀灭病原菌的同时，也影响到正常的肠道菌群平衡。吉米沙星可以抑制双歧杆菌的生长，莫西沙星可以抑制乳酸杆菌的生长。停用这两种抗生素后，肠道内的菌群平衡需要一个多月才能得以恢复。
(五)内毒素血症
自100多年前从革兰阴性菌中发现了对热稳定且具有生物学活性的内毒素(endotoxin)以来，已经证实了内毒素在革兰阴性菌所致脓毒症、急性肝衰竭、失血性休克等疾病基础上发生的内毒素血症的病理生理过程中起着极其重要的作用。内毒素与重型肝炎的发生、发展有密切关系，内毒素及内毒素启动导致单核-巨噬细胞释放大量细胞因子(如TNF-α、IL-1等)是肝细胞凋亡、坏死的主要原因之一。慢性肝病患者常有较高的内毒素血症发生率，一般认为与其易发生感染、肝脏清除内毒素功能下降有关。
根据资料，慢性肝病患者存在不同程度的肠源性内毒素血症，此时患者常伴有肝脏解毒功能下降、门静脉高压、低蛋白血症、胃肠道淤血与黏膜水肿等情况。但临床及动物研究表明，感染尚不能完全解释高内毒素血症发生率，研究表明，慢性肝病患者肠道定植抗力下降、肠道革兰阴性杆菌过度生长繁殖、胆盐缺乏等因素是其肠道内毒素池扩大的原因，并存在肠道内毒素过度移位的情况。因此，慢性肝病的高内毒素血症发生率除与前两者有关外，肠道内毒素过量移位也是其影响因素之一。肠道内毒素移位后经门静脉进入血液，可直接或间接损伤宿主免疫功能，进一步加重肝损害，增加肠黏膜的通透性，引起肠道菌群移位，导致肠道菌群失调。
(六)上消化道出血
上消化道出血最常见的为食管和胃底静脉曲张破裂出血。食管和胃底静脉曲张破裂出血和门静脉的压力有一定关系，当门静脉压力大于2.94 kPa时容易出血，且自动停止的机会很少。而门静脉高压与循环高动力有关，一氧化氮是重症肝炎肝硬化血流动力异常的关键因素。细菌移位包括活菌及其产物、内毒素及细菌胞壁成分，这些物质可诱导一氧化氮及细胞因子的合成，从而导致高动力循环状态下的上消化道出血。
(七)肝性脑病
肝性脑病发病机制复杂，除水、电解质、氨基酸代谢紊乱及酸碱失衡，血氨升高外，假性神经递质、短链脂肪酸(C4～C6)增加也是其原因之一，这些物质多来自肠道，由肠道细菌代谢产生，与重型肝炎患者肝脏清除功能下降有关。调节肠道微生态可能有助于降低血液中这些有毒物质的浓度，降低肝性脑病的发生率。
(八)肝肾综合征
肝肾综合征是重型肝炎、急性肝衰竭及肝硬化腹水常见的肾并发症，是由严重肝病引起的肾衰竭。但其临床实验室检查和形态学都无肾病的表现。慢性肝病时，内毒素血症的出现与肌酐清除功能下降有关，肝病时肠源性内毒素血症对肾脏的作用可能如下：①内毒素可激活肾素-血管紧张素系统，提高肾血管儿茶酚胺的敏感性，使肾血管强烈收缩，致肾脏血流动力学发生改变，形成皮髓分流，肾脏缺血，但并不引起肾实质损害，一旦病因去除，肾功能可发生逆转；②使机体发生Schwartzman反应，造成肾小球和肾周毛细血管内纤维蛋白沉淀和血管阻塞，严重时可导致肾小管急性坏死，甚至肾皮质坏死。肠源性内毒素血症所致的功能性肾衰竭和急性肾小管坏死是肝硬化患者死亡的主要原因之一。
三、乙型重型肝炎的微生态防治
乙型重型肝炎患者有相当程度的肠道微生态失调，且肠道微生态失调又可通过各种方式加重原有肝损害。因此两者之间存在密切联系，互为因果，可形成恶性循环，导致严重的临床后果。肠道微生态调节治疗是肝病综合治疗的一个不可缺少的方面，应强调预防为主，兼顾治疗，可取得一定的临床疗效。
(一)选择性消化道脱污染
该疗法采用窄谱抗生素去除肠道革兰阴性杆菌(GNR)及真菌，尽可能保护肠道专性厌氧菌，减少肠道GNR过度繁殖，缩小肠道内毒素池水平，减少细菌移位，降低感染的发生率及内毒素血症的发生率。该法在防止继发感染方面已取得了肯定的疗效。
一项纳入48例肝硬化患者，为期两年的对照研究中，使用诺氟沙星的选择性消化道脱污染(SDD)疗法提升了患者Treg比例，减轻了促炎反应，起到了免疫调节的作用。另外一项多中心随机双盲对照研究采用利福霉素1200mg/d短期(5～10天)治疗肝硬化肝性脑病，取得了比较好的疗效，总有效率达到81.6％。西班牙学者曾应用诺氟沙星在预防肝硬化腹水患者自发性腹膜炎的发生方面取得了比较好的疗效。但考虑到慢性肝病病程较长，长期应用抗生素，一方面易诱导耐药菌的产生，另一方面可因应用抗生素不当，而导致药物性肝损害，加重肝病病情，同时在一项纳入103项研究的Meta分析中，SDD疗法局部抗生素应用对继发念珠菌感染的间接效应，与其传统危险因素直接效应的程度相似，提示了使用SDD对念珠菌感染的促发作用。因此有学者认为，SDD疗法应该严格限制于那些易发生细菌感染的高危患者之中。
目前一般认为短期采用SDD疗法治疗肝病是相对安全的，长期使用有待商榷。
(二)微生态调节剂的应用
1.益生菌
微生态调节剂主要包括医学益生菌、益生元(prebiotic)和合生元。
益生菌的英文是probiotic，源自希腊语，意思是为了生命(for life)，Sperit(1971年)将其定义为能促进微生物生长的组织提取液，Paker(1971年)将这个词定义为对肠道菌群平衡有贡献的物质。1989年，Fuller将益生菌定义为能够促进肠道内菌群生态平衡，对宿主起有益作用的活的微生物制剂，强调益生菌必须是活的微生物成员，死菌及代谢产物则不包括在内，1992年又对益生菌给出了更为详细的描述，应该符合以下几个标准：①益生菌必须有存活能力，并能进行工业化生产；②在使用和储存期间，应保持存活状态和稳定性；③在肠道内或其他生活环境具有存活能力(不一定能自我繁殖)；④必须对宿主产生有益的作用；⑤无毒，无害，安全，无副作用。
Aramer等(1996年)认为益生菌是含有生理性活菌或死菌(包括其组分和代谢产物)，经口服或其他途径投入，旨在改善黏膜表面的微生物群落或酶的平衡，或刺激机体特异性或非特异性免疫机制，提高机体定植抗力或免疫力的微生物制剂。
目前研究较多的医学益生菌主要有双歧杆菌和乳酸杆菌两大类。补充医学益生菌的目的在于恢复肠道微生态平衡，修复肠道细胞及菌膜屏障，提高肠道定植抗力，抑制潜在致病菌过度生长，减少肠道有害代谢产物的生成，促进肠上皮细胞黏蛋白分泌及潘氏细胞sIgA的分泌，改善消化道动力，减轻机体代谢相关疾病，抵抗氧化应激，调节全身免疫功能等。双歧杆菌和乳酸杆菌等肠道正常菌群有一定的抗炎作用，针对炎症性肠病治疗的研究提示两者都能对疾病起到积极的影响。益生菌菌株的选择、功能的确定及如何保证足量有效的活菌进入肠道是当前需要加强研究的问题，否则会影响其临床疗效。目前国内和国外有200多种益生菌制剂，现在在我国应用的益生菌活菌制剂有丽珠肠乐、培菲康、金双歧等，死菌制剂有乳酸菌素片、乐托尔等，其中疗效比较确切的有Lactobacillus rhamnosus GG(LGG)、植物乳杆菌(L.plantarum 299)等。
在动物研究中给肝缺血再灌注大鼠预先补充乳酸杆菌和双歧杆菌的混合制剂，22h后发现可部分恢复肝缺血再灌注时所致的肠道微生态失调，并改善肠黏膜屏障，减少肠道菌移位的发生率，进而降低血浆内毒素水平、减少肝脏氧自由基的产生、减轻肝损害。国外学者在应用乳酸杆菌制剂预防肝硬化门静脉高压症患者上消化道出血中取得了一定的效果：治疗后胃镜检查发现曲张的食管静脉红色征消失，B超检查门静脉直径缩小(p<0.05)。
双歧杆菌和乳酸杆菌联用效果似乎要好于单用双歧杆菌或乳酸杆菌，目前益生菌加用抗氧化剂或肠黏膜营养剂是国际上研究的一个热点，已经在动物肝病模型上取得了比较好的效果。今后需要在此基础上进行大规模的临床肝病肠道微生态干预研究，以确定其疗效及机制。(https://www.daowen.com)
随着近几年的研究，以普拉梭菌和Akkermansia muciniphila等为代表的新型益生菌逐渐进入研究者的视线。在其他重型肝病模型中，直接补充普拉梭菌或者Akkermansia muciniphila被证明能够改善肠上皮细胞紧密连接，减轻内毒素血症，进而降低机体炎症水平，缓解肝组织内促炎细胞的浸润和炎症因子的生成，抑制肝细胞的凋亡，改善肝功能指标。提示此类新型益生菌对肝脏损伤的有益作用，后续针对乙型肝炎重症患者的相应研究具有广阔的前景。
有资料证明益生菌的应用是安全的，用益生菌如鼠李糖乳杆菌(HN001)、嗜酸乳杆菌(HN017)、双歧杆菌(HN019)喂食小鼠并未发现对其各项健康指标的影响，也未发现益生菌移位现象。虽然乳酸杆菌和双歧杆菌在临床上造成感染的报道很少，但是研究者在急性肝损伤的动物模型中发现了乳酸杆菌移位现象；最近有学者报道了某些对人体有益的厌氧菌造成的感染，如唾液乳杆菌就造成了一名70岁老人胆道感染；在动物实验中也发现了乳酸杆菌引起的细菌移位现象。对肝衰竭大鼠喂食动物双歧杆菌，发现移位至肠系膜淋巴结的细菌数量增加。虽然这些细菌移位发生在免疫力低下的条件下，但也应当引起关注。除菌群移位之外，在体外研究中，也有益生菌向有害菌转移抗性基因的情况发生。同时在近年的一些研究中发现益生菌的应用可能会导致不良的代谢过程，比如结合胆汁酸的脱结合以及乳酸类产物增加引起的乳酸血症。因此在临床大规模应用益生菌过程中，务必要关注早产儿、免疫受损人群、重症患者等高危群体潜在的不良反应。益生菌的应用需要做到个性化使用，现在由于技术条件的限制，对微生态的研究大多停留在优势菌属的水平。对不同种的细菌在不同疾病发病过程中的变化规律没有进行详细研究。同时，肠道内细菌的构成受到基因、年龄、饮食、环境及工作等方面的影响，不同的个体肠道内的细菌构成也不一样。例如，老年人体内双歧杆菌减少，而婴儿体内的分枝双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、短双歧杆菌和齿双歧杆菌在成人体内也较少。因此只有做到微生态制剂的个性化使用才能更好地调节肠道菌群。
2.益生元
在最新的专家共识中，Gibson和Hutkins等(2017年)认为益生元是一种能被宿主微生物选择性利用，并对机体产生有益影响的基质。益生元应具备以下4个特点：①在胃肠道的上部，既不能水解，也不能被吸收；②只能选择性地促进某种有益菌生长繁殖或激活其代谢功能；③能够优化肠内有益于健康的优势菌群的构成和数量；④能起到增强宿主健康的作用。益生元包括乳果糖(杜秘克)、乳梨醇(拉克替醇)、果寡糖、菊糖、半乳寡糖、大豆寡糖等制剂。另外食物中的不消化淀粉、植物纤维素、母乳和某些中药中的寡糖成分也具有特定的促进某些细菌生长的功能。在众多功能性低聚糖中，常用于调节慢性肝病肠道微生态的是乳果糖和乳梨醇，它们均为合成双糖，乳果糖又称β-1，4-半乳糖苷果糖，或称乳酮糖，含有一分子半乳糖和一分子果糖；乳梨醇又称拉克替醇，是半乳糖和山梨醇的缩合物。它们能通过选择性地促进有益菌的生长以提高定植抗力，并借此抑制潜在致病菌生长及其有害代谢产物的产生，以减少内毒素的产生。同时，体外研究发现乳果糖还可直接灭活内毒素，并通过其酸性代谢产物促进肠蠕动，加快肠道细菌及毒素的排出，且几乎无任何毒副作用。
1966年，Bricher等首次利用乳果糖治疗肝性脑病获得成功，1982年，他们利用乳梨醇治疗肝性脑病也同样获得成功，肝性脑病发病机制很复杂，其中，氨中毒学说被广为接受。目前认为乳果糖和乳梨醇治疗肝性脑病的机制如下：通过纠正肠道菌群失调，选择性刺激肠道有益菌双歧杆菌及乳酸杆菌的生长，同时抑制大肠杆菌、产气荚膜梭菌等产尿素酶的细菌以减少氨的产生；降低肠道pH，酸化肠道，使氨转化为铵离子，减少粪氨的产生，促进血氨向肠道转移；提供高渗性的肠道环境，缓解肠壁水肿，改善肠道屏障功能，减少肠道内氨吸收；低pH可刺激肠蠕动，减少肠道内有毒物质与肠壁接触时间，减少氨的吸收，从而避免内毒素血症和氨性昏迷的发生。关于服用乳梨醇及乳果糖后肠道内pH降低的机制目前认为是因为它们本身被分解后产生乙酸、乳酸等短链脂肪酸，另外在刺激乳酸杆菌等乳酸菌增殖后，在乳酸菌的代谢过程中也会产生部分短链脂肪酸。
国内有学者对13例门体分流术的肝性脑病患者用乳果糖治疗一周后肠道pH下降、血氨和精神-神经症状显著改善(2000年)。使用乳果糖长期维持治疗能够降低血氨、改善智力测验结果并可能防止亚临床肝性脑病的恶化，最终降低肝性脑病的发生率。
Tarao等给8例肝硬化及肝性脑病的患者服用乳梨醇(36 g/d)3～4周后发现：粪便内双歧杆菌和乳酸杆菌数量上升，一些与产氨有关的类杆菌和需氧菌数量下降，同时肠道pH下降，血氨和肝性脑病的临床症状也随之改善。
Scevola用乳梨醇(40 g/d)治疗慢性肝病30天后发现血清内毒素水平明显下降，同时对其中5例患者肠道内菌群进行定性、定量分析发现：双歧杆菌和乳酸杆菌明显上升，产气荚膜杆菌、类杆菌及肠杆菌科细菌明显下降，并认为内毒素水平下降与其调节肠道菌群有关，王清图等对30例Child-Pugh C级肝硬化患者进行治疗后发现患者血氨和内毒素明显下降。
近年来有文献报道对30例慢性病毒性肝炎伴肠源性内毒素血症的患者加用乳梨醇(拉克替醇)治疗3周后，发现拉克替醇可促进肠道有益菌(如乳酸杆菌和双歧杆菌)的增生，抑制产气荚膜梭菌的生长，进而显著降低血内毒素水平，从(72.89±20.29)ng/mL下降到(33.33±15.63)ng/mL。患者临床症状明显改善，生活质量也有较大的提高。
近来的一篇纳入5项随机研究和6项观察研究，总计2276个病例的Meta分析发现，对于肝性脑病患者，相比于传统的乳果糖治疗，乳果糖+利福昔明的综合治疗方案能够增强疗效，降低病死率。但综合治疗方案对不同亚型肝性脑病的具体影响还需要进一步研究。
临床应用乳果糖预防、治疗肝性脑病已取得了非常肯定的疗效，应用乳果糖或乳梨醇，在选择性刺激肠道有益菌双歧杆菌及乳酸杆菌生长的同时，抑制肠杆菌科细菌的生长，减少有毒代谢产物的产生；又可通过产生短链脂肪酸(C2、C3、C4)如乙酸、乳酸，使氨酸化为铵离子，并以此为其生长所需的氮源，减少肠道氨的产生，同时又可刺激肠蠕动，促进肠内有毒物质的排出，这在肝硬化肝性脑病治疗中已得到了广泛应用，疗效也得到了充分的肯定。因此，调节肠道菌群，扶植以双歧杆菌为主的专性厌氧菌可降低肠道有毒产物的产生，减少人体的吸收。
摄入益生元可增加内源性双歧杆菌和乳酸杆菌的数量是肯定的，但益生元对人体健康的作用尚需通过更深入的实验来证实，这就要求能更好地理解其作用机制并通过分子手段来了解肠道菌群的变化。研究益生元应该涉及如下内容：①发酵速度的快慢；②在结肠的哪个部位被发酵；③发酵到何种程度；④能促进何种细菌，抑制何种细菌；⑤发酵产物的鉴定。需要开发有专门作用位点的益生元，需要更多的有益健康的研究报告，通过应用益生元来改变由内源性细菌所引起的不健康状态。
另外益生元较益生菌有若干优越性，比如不存在保存活菌的技术难关，稳定性好，有效期比较长等，值得临床推广应用。
3.合生元
合生元为益生菌和益生元的混合制剂，其起到的作用不是简单的相加，而是协同作用。考虑到肠道内细菌的多样性和复杂性，采用单一的菌群疗法似乎显得力不从心。目前国际上越来越多实验室将益生菌和低聚糖合并使用，并取得了一定的效果。其中很多是将双歧杆菌、乳酸杆菌和发酵型纤维联合应用的，合生元将是今后重点研究的方向，但其中各种成分的搭配、剂型，以及剂量和疗程的选择需要更多临床试验加以验证。
最近学者在证实了肝硬化亚临床性肝性脑病患者存在肠道菌群紊乱的基础上，采用合生元(四种冻干保存的菌种和发酵型纤维)治疗肝硬化亚临床性肝性脑病取得了一定的疗效。治疗后发现其在显著提高肠道内乳酸杆菌水平和降低肠道内大肠杆菌、葡萄球菌及梭菌属细菌水平的同时，还可改善肝脏功能，降低血内毒素和血氨的水平和肠道内pH，并且可以显著改善患者亚临床性肝性脑病的Child-Pugh的分级(47％)，有50％的患者的亚临床性肝性脑病得以逆转。
在近年的一篇纳入49例肝性脑病的随机分组安慰剂对照临床试验中，使用合生元和支链氨基酸的综合疗法，相比于单用两者而言，患者的各项临床指标和精神状况都有进一步的改善。
另外微生态制剂的使用是一个长期过程，实验发现，益生元虽然可以促进肠道内双歧杆菌的生长，但是一旦停用益生元，血氨可能会恢复到服用前的水平。微生态制剂要达到对免疫系统的调节，使用时间也要达到数周以上。而口服双歧杆菌后产生的抗氧化作用需要两周后才明显。因此，微生态制剂调节免疫的作用在肝衰竭患者中的意义有限，肝衰竭患者仍然需要采用包括营养支持治疗在内的所有综合治疗方法，微生态制剂的使用只是治疗方法之一。
4.微生态制剂在肝病中的应用机制
肠道内有400多种细菌，其中以双歧杆菌和乳酸杆菌为主的有益厌氧菌吸附于肠道上皮细胞，构成膜菌群；而肠杆菌科细菌等有害菌则位于肠腔内，构成腔菌群。双歧杆菌通过占位阻止肠杆菌科细菌对肠上皮细胞的黏附。在重型肝炎的发病过程中，有益菌数量的减少和肠杆菌科细菌的过度生长使得肠杆菌科细菌更容易吸附于上皮细胞。使用益生菌可以直接提高肠道内有益菌的数量，竞争性排斥致病菌对肠上皮细胞的吸附；益生菌吸附于肠上皮细胞后可以阻止信号的转导，抑制某些基因的表达，减少细胞因子的合成和释放；同时，可以通过分解肠道内的难以消化的碳水化合物等产生大量的酸性物质如乙酸、丙酸、丁酸等，从而降低肠道内的pH，抑制致病菌的生长。国外研究表明，乳酸杆菌和双歧杆菌对肠上皮细胞的黏附性强于大肠杆菌(如O157：H7)，可以竞争性地黏附于肠上皮细胞，而这种抑制作用可能是通过合成乳酸和某种蛋白质来完成的。其他实验也表明，给小鼠口服乳酸双歧杆菌(HN019)可以抑制肠道沙门菌、大肠杆菌O157：H7感染。合成杀菌物质也是有益菌抑制病原菌的方式，某些双歧杆菌合成的相对分子质量低于3500的亲脂分子具有明显的抗菌活性，可以抑制细菌进入细胞内，甚至可以杀灭细胞内的细菌。乳酸杆菌也可以合成同样的抗菌物质。
益生元的结构主要是各种低聚糖，它们能为有益菌提供能量，因而可以特异性刺激某些有益菌的生长。大多数的乳酸杆菌和双歧杆菌可以分解果寡糖。果寡糖也能够减轻胆酸盐对双歧杆菌的抑制作用，而且被分解后使得肠道内丁酸的合成增加。益生元的寡糖结构同肠上皮细胞外的糖链结构类似，可以竞争性地同细菌进行结合，阻止细菌对肠上皮的吸附。促进有益菌的生长也是益生元的重要作用。不同的寡糖对有益菌的促进作用不同，母乳中的寡糖可以刺激肠道中的婴儿双歧杆菌的生长；菊糖在结肠内可以将乳酸杆菌的数量增加10倍，也能增加消化链球菌、肠球菌和艰难芽孢梭菌的数量，但对双歧杆菌的数量仅能轻度增加；果寡糖在体内和体外试验中都可以增加肠道内双歧杆菌的数量。
完整的肠道黏膜上皮细胞，细胞间的紧密连接构成黏膜屏障，阻止大分子物质的侵入。肠道黏膜杯状细胞分泌黏液(主要为高分子的黏蛋白)覆盖于肠上皮细胞，为专性厌氧菌生长、黏附提供适宜的环境，也可以阻止潜在致病菌的生长。正常的肠蠕动能排除致病菌，减少其在肠道内的停留时间。肝衰竭时，门静脉高压、肠黏膜水肿使得肠上皮细胞的完整性遭到破坏，因而可以导致细菌和毒素(内毒素)的移位。肠道内的细菌可以调节肠上皮细胞内的基因表达，增强肠道黏膜的完整性。益生菌通过多种途径保护肠道黏膜的完整性。肠道内的有益菌不仅不会分解肠黏液，还可以促进肠黏蛋白的分泌；增加益生菌后可以增加肠道内不消化淀粉的分解，而且分解后产生的大量酸性物质可以刺激肠道的蠕动，减少致病菌在肠道内的滞留，有益菌分解肠道内碳水化合物产生的丁酸也能够为肠上皮细胞提供能量。在肝病的发病过程中，肠道内氧自由基的增加可以加重对肠道黏膜屏障的损伤，进而引起细菌移位，而抗氧化剂可以减少细菌移位。益生菌同样具有抗氧化作用，可以降低氧自由基对上皮细胞的损害。乳酸杆菌和双歧杆菌能够降低亚麻酸过氧化物的生成，抑制硝基奎宁-N-氧化还原酶的活性，并不同程度保护脂质膜不受氧自由基的攻击。有益菌通过抑制某些细胞因子的分泌，减轻细胞因子的破坏作用，因而也可以保护肠道黏膜屏障。例如，给IL-10基因敲除小鼠喂食益生菌可以恢复大肠的生理功能和屏障的完整性，其作用机理是间接抑制TNF-α和IFN-γ的分泌。当然，抑制细菌毒素也可以保护肠道黏膜屏障：益生菌可以通过抑制肠上皮细胞内某些蛋白质的合成，从而降低大肠杆菌VT毒素的影响。
肠道相关淋巴组织(GALT)是体内重要的免疫器官，包括上皮内的淋巴细胞、淋巴滤泡Peyer’s细胞和肠黏膜淋巴结，它们在防止潜在致病菌的黏附和移位中发挥重要作用。作用最为突出的是淋巴细胞和浆细胞产生的IgA(sIgA)，它能与抗原决定簇结合，阻止其对肠上皮细胞的黏附。重型肝炎的发病中，补体合成不足，多形核白细胞移动、巨噬功能下降，肝Kupffer细胞吞噬功能下降，CD4细胞减少和CD8细胞的增加表明细胞免疫受到一定抑制。免疫功能失调是导致重型肝炎患者肝细胞损伤的重要原因，而有益菌则可以调节机体的免疫状态，不同的菌株所调节的免疫细胞不同，这些调节作用不相同可能是由对DC的激活作用不同而引起的。体外试验表明，L.reutei能够上调DC表达MHC-Ⅱ类分子、B7-2和IL-10，进而激活Th2细胞，产生免疫耐受；L.casei则上调DC表达MHC-Ⅱ类分子、B7-2和IL-12，进而激活Th1细胞。细菌对DC的作用也有相互抑制的现象。L.reutei就可以抑制L.casei对DC的作用。体内试验证明，小鼠喂食双歧杆菌(HN019)和乳酸杆菌(HN001和HN017)后，外周血和腹腔中的白细胞吞噬活性增强；脾脏细胞对刀豆素A和脂多糖刺激反应明显升高；在刀豆素A的刺激下，淋巴细胞合成IFN-γ的能力、血清中抗体对抗原反应能力增强。双歧杆菌提高小鼠对沙门菌抵抗力的同时也伴随免疫力的提高，包括脾脏内淋巴细胞对丝裂原反应的增加，外周巨噬细胞活性的增加和肠道内抗沙门菌抗体合成增加。益生菌提高小鼠对大肠杆菌O157：H7的耐受的同时也伴随免疫功能的改善。对老年人的研究也表明益生菌有同样的免疫调节作用。老年人连续口服含乳酸杆菌的牛奶后，外周血细胞的吞噬活性提高，IFN-α的合成增加，肠道IgA的分泌增加；提高血液中巨噬细胞的活性，增加肠道内的IgA和IgE的抗原反应；在细胞免疫方面，口服乳酸杆菌后的老年人血液中CD4、CD25、NK细胞的数量增加。
肝脏中的巨噬细胞又称Kupffer细胞，能够清除来自肠道门静脉系统内的细菌和内毒素。肝实质细胞能够代谢肠道的多种有害物质，如氨、胺类和酚类物质等。胆汁酸盐可以同肠道内的内毒素结合，形成不能吸收的复合物，阻止内毒素的吸收。在肝衰竭的过程中，肝脏代谢功能下降，许多代谢产物出现滞留。胆酸盐可以抑制双歧杆菌的生长，重型肝炎发病过程中胆酸盐的滞留也可能是导致肠道B/E值下降的原因之一。肠杆菌科细菌的过度生长，使得肠道内的尿素分解、氨生成增加，加重了肝脏负担。实验也发现，肝衰竭的大鼠肠道内肠杆菌科细菌增加的同时，内毒素也出现增加。体外试验表明，加入益生菌后在减少粪便中氨的释放、益生菌的增殖过程中又可以利用游离氨合成自身需要的蛋白质。益生元不仅调节有益菌的生长，也调节肠道酶的活性，不同的益生元对肠道内酶的活性影响是不同的，如菊糖、果寡糖可以降低肠道β-糖苷酶和β-葡萄糖醛酸苷酶的活性，并提高一氧化氮还原酶和偶氮还原酶的活性，但是菊糖可以增加芳香基硫酸酯酶的活性，而果寡糖则抑制该酶活性。人体试验表明服用由乳酸杆菌和果寡糖制成的益生元后，降低尿素酶、β-葡萄糖醛酸苷酶活性，可能会减少尿素、结合型胆红素的分解，从而阻断氨和胆红素的肠肝循环。
重型肝炎患者在发病过程中出现不同程度的恶心、呕吐和食欲不佳等症状，这些在不同程度上导致患者营养状况不佳。在补充营养的同时加用益生菌可以增加营养。丽珠肠乐、培菲康等益生菌在肠道内可以增加维生素B1、维生素B2、维生素B6、烟酸、维生素K1的合成等，并促进无机盐和微量元素、维生素D1的吸收。益生菌可以减少毒素吸收，双歧杆菌对黄曲霉素有吸附作用，而服用乳酸杆菌可以降低血清中多种毒素，如内毒素水平。
除通过调节肠道菌群降低血内毒素、血氨外，乳果糖等低聚糖还能促进动物肠道内IgA的分泌，明显提高NK细胞活性，增强肠黏膜B淋巴细胞的反应，增强免疫功能。此外还能调节肠黏膜上皮细胞的分化成熟，增加肠道屏障功能，防止内毒素移位，Nicole Marhamt等给大鼠的饲料添加10％的果寡糖16天后发现除了对肠道淋巴结有免疫刺激以外，果寡糖还能影响肠道的黏膜免疫系统。但目前此类研究仅集中在动物实验及健康人体试验中，增强肝病患者肠黏膜屏障作用、防止内毒素移位等作用尚有待进一步临床研究证实。
5.其他调节肠道微生态的药物
(1)胆盐：胆汁可抑制肠道内许多细菌的生长，动物实验证实胆道梗阻导致小肠内细菌过生长，并促进细菌移位。另外Vicente等分别在动物实验中发现给肝硬化SD大鼠全程灌服结合型胆盐可以明显改善肠道菌群，促进胆汁分泌，减少细菌移位的发生率和降低血内毒素水平，并可以增加动物生存率。
(2)胃肠动力药物：肝病患者常有胃肠动力障碍，肠动力异常易导致小肠内细菌过生长，从而导致细菌移位，引起感染。国外有学者发现，利用胃肠道动力促进药西沙必利可以显著加快肝硬化大鼠肠蠕动，调节肠道菌群。临床研究表明，肝硬化患者使用西沙必利6个月可降低口-结肠转运时间，同时可清除约80％患者的IBO。研究还显示，安慰剂组有2例(2/10)患者发生了SBP及尿路感染，而治疗组未见有感染的发生。
四、乙型重型肝炎微生态学研究展望
目前研究表明，肝病与肠道微生态有密切的关系。肠道微生态失衡对重型肝炎的发生、发展起着关键的作用，而且用微生态调节剂治疗肝病已经取得了初步的成果，有着广阔的应用前景。但同时，也有众多机制尚需进行深入研究。过去由于技术方法的局限性，很难深入研究人体肠道微生态对肝病的影响。
20世纪70年代末，16S rRNA基因序列的分析为微生物种系进化关系和多样性认识提供了强有力的工具。例如，基于16S rRNA/rDNA序列设计寡核苷酸探针的荧光原位杂交(FISH)技术对复杂样本中的微生物进行检测和定量。FISH结合流式细胞仪技术使直接检测更快速和高通量。竞争PCR和实时荧光PCR(real-time PCR)检测技术比寡核苷酸探针杂交技术可更准确地定量检测肠道微生物。此外，近年来基于变性/温度梯度凝胶电泳(denature gradient gel electrophoresis，DGGE)、末端限制性片段多态性(terminal restriction fragment length polymorphism，TRFLP)、脉冲凝胶电泳(PFGE)、核糖体结合序列型扩增核糖体DNA限制性分析(ARDNA)等为代表的DNA指纹图谱技术，以其快速、动态监测并同时比较不同个体、不同环境等的微生物群落结构变化等优点，在微生态学的各个领域中得到广泛应用，是研究环境中微生物群落结构的主要分子生态学方法之一。指纹图谱和测序技术，不仅直观地展现复杂微生物群落的结构特征，还可观察群落中微生物的部分系统发育信息，但是这些研究片段较小，信息量较少。
目前，随着16S rRNA克隆文库技术的应用，人们对肠道微生物有了新的认识。对微生物的标志基因即16S rRNA基因进行测序，可以全面而深入地反映环境微生物群落结构的多样性。例如，美国Eckburg小组通过对3位美国人的健康个体肠道、不同部位的菌群结构的16S rRNA全长基因分析发现，人体肠道菌群是一个个体差异大、远比人们认为的更加复杂的一个微生态系统。
对于一个微生物群落，不仅要对其组成结构的多样性进行分析，还需要从中发现与该群落功能相关的重要功能菌或功能基因。元基因组学技术利用高通量、大规模测序，可以直接获得反映肠道微生物功能的基因组信息，为人们研究肠道微生物与宿主健康、疾病的发生及发展的关系提供了一个新的技术平台。元基因组是指在特定生活环境中的所有微生物的基因组的总和。元基因组学是一种不依赖培养的方法，其主要技术策略是多重克隆法，直接从环境样品中提取混合菌群的总DNA构建大插入片段的环境基因组DNA BAC文库或Fosmid文库，然后用和微生物系统进化相关的基因标志，如16S rRNA基因，筛选克隆，通过测序可以得到更多难以或不能培养的微生物及从未发现的新的物种的基因组片段的信息，通过活性筛选可以发现新的物种功能基因或新的功能酶。
最新出现的高通量短标签测序策略，以454新型测序技术和纳米测序技术为代表，以快速、高通量获得的大量微生物基因组短标签序列，反映微生物群落功能基因谱。此技术与传统的Sanger测序技术结合，使元基因组测序更经济、有效，质量更高，成本更低。应用此技术比较分析肥胖小鼠和正常小鼠的肠道元基因组结构和组成，发现肥胖小鼠的肠道菌群组成更容易从食物中获取能量。此技术可能会成为研究肠道菌群与人体健康和疾病关系的重要方法。通过对肠道菌群元基因组测序，人们对肠道微生态与人类健康的关系有了新的认识。
此外，肠道微生态研究中，不仅需要了解菌群的结构、组成和功能，而且需要了解宿主对微生物的反应。基因芯片如低密度细胞信号转导通路(signal transduction pathway)、功能芯片如TLRs通路芯片，可以检测、监测宿主细胞对不同病原菌感染的特异性反应。鉴定肠道微生态在不同状况下，宿主的新的细胞信号转导通路和其他细胞分子标志物。根据这些新发现的基因结合原有的数据，研制特异性肠道微生态优劣鉴定芯片，大规模监测宿主对不同微生态结构基因组的反应，理解肠道微生物与宿主的作用机制，并作为临床用药和治疗的依据。
从精准诊断和医疗的角度来看，找出与疾病发生、发展有关的特定菌株，进而研究致病或缓解疾病的机制，对人体微生态学而言无疑是一个值得深入研究的方向。目前常用的基于基因测序研究微生物群的方法只能间接展示微生物组特征，实际检测的灵敏度和准确度有待提高。这对微生物群中特定微生物的分离培养提出了要求。目前国际上已有一些研究团队对人体微生物群中的部分微生物进行分离培养并提出了培养组学概念。基于培养的方法也将是微生物群(组)研究的“金标准”。但在培养方法尚未完善和规范之前，人体大多数微生物仍将难以实现大规模的分离和体外培养。在这一背景下，以核糖体RNA测序和宏基因组测序为代表的分析技术在肠道微生物群的研究中仍将发挥关键作用。
随着单细胞测序技术的兴起，应用于微生物群分析的单细胞测序也逐步在研究中被推广。现有的宏基因组学、宏转录组学、宏代谢组学手段，DNA/RNA稳定的同位素探针，甚至培养组学方法，都不能直接揭示微生物群中不同组分之间的代谢互作关系。拉曼组学——一种新型无标记的单细胞水平功能成像手段，能够检测微生物群体的功能和表型异质性，可以作为宏基因组学、宏转录组学和宏代谢组学的补充技术，来更好地诠释微生物群的状态。在技术多元化和高速发展的前提下，对微生物群(组)数据进行规范和深度挖掘仍有待解决。利用活菌制剂进行微生物干预的方法来治疗乙型肝炎重症化所致的感染尽管已经取得了一定的效果，但是目前研究显示仅有少数菌株起到一定的效果，所以如何选择益生菌及保证有足够数量的活菌进入肠道并起到相应作用是需要进一步探索的，而且这些菌株在肠道中怎样杀灭和抑制致病菌、如何阻断致病菌的致病过程和增强对感染的抵抗力的机制尚需进一步阐明。
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