猪链球菌（S.suis）
1.形态染色
革兰阳性，圆形或椭圆形，单个或双个，少数呈短链状排列。陈旧培养物可能呈革兰阴性，在液体培养基中以链状为主，能形成荚膜，无芽孢（图3-1-1）。
2.培养特性
多数兼性厌氧，最适pH 为7.4～7.6，最适培养温度为36℃。营养要求丰富，接种在哥伦比亚（TSA、脑心浸液琼脂）血平板上36℃培养24h，形成细小、圆形微凸、表面光滑而湿润的灰白色菌落，菌落直径1～2µm。α 或β 溶血，有的为α 溶血，但延时培养后则变为β 溶血［图3-1-2］。猪链球菌2 型在绵羊血平板上呈α 溶血，而在马血平板上则为β溶血。在BHI、TSB、马丁肉汤（添加动物血清）等液体培养基培养，肉汤混浊。
图3-0-1 革兰氏阳性球菌（兼性厌氧菌和专性需氧菌）的鉴定思路
（引自《临床微生物学诊断方法与应用》，Nader Rifai、Carey-Ann Burnham、Andrea Rita Horvath 主编；汤一苇、潘柏申主译，上海科学技术出版社，2022 年1 月）
图3-1-1 猪链球菌镜检形态
（a）革兰染色（血平板培养）；（b）革兰染色（BHI 液体培养）；（c）透射电镜；（d）扫描电镜
3.生化反应
触酶阴性，七叶苷、精氨酸双水解酶、淀粉水解试验阳性，不分解甘露醇，V-P、马尿酸钠试验阴性，10℃、45℃、6.5% NaCl、pH 9.6 肉汤中均不生长。生化特性详见表3-1-1。
图3-1-2 猪链球菌在血平板上菌落特征
（a）α 溶血；（b）β 溶血
表3-1-1 链球菌属主要病原性链球菌的特性
（续表）
注：+，阳性反应；-，阴性反应；（+），反应缓慢；d，阳性或阴性因菌株而不同。
4.分离鉴定
（1）猪链球菌分离鉴定流程：扁桃体、鼻腔拭子可接种到选择性THB 增菌液试管中，36℃培养24～48h 后再划线接种到血平板上。猪链球菌在血平板上形成α 或β 溶血、圆形的小菌落，革兰阳性，短链；触酶试验阴性，不分解甘露醇，纯培养细菌可以进一步用商品化细菌鉴定试剂盒进行鉴定。具体流程见图3-1-3。
图3-1-3 猪链球菌分离鉴定流程
（2）猪链球菌与其他细菌鉴别：主要有以下几种。
① 猪链球菌与肠球菌鉴别：猪链球菌在45℃、6.5% NaCl、pH9.6 肉汤中均不生长，而肠球菌均生长。
② 猪链球菌与葡萄球菌鉴别：猪链球菌触酶试验阴性，6.5% NaCl 培养基不能生长；葡萄球菌触酶试验阳性，6.5% NaCl 培养基能生长。
③ 猪链球菌与马链球菌兽疫亚种鉴别：按兰氏分群，猪链球菌为R 群，马链球菌兽疫亚种为C 群。按菌落形态分，猪链球菌为光滑、圆形的小菌落，短链；马链球菌兽疫亚种为黏液的露滴状菌落，长链。按溶血性分，猪链球菌为α 溶血或β 溶血，β 溶血不明显；马链球菌兽疫亚种在血平板上为明显的β 溶血。
（3）猪链球菌血清型鉴定：猪链球菌根据荚膜抗原的不同分为33 个血清型（1～31、33及1/2）及相当数量无法定型的菌株（non-typeable strains，NT），其中1、2、7、9 型为猪的致病菌。血清凝集或协同凝集是当前鉴定猪链球菌各血清型的经典方法。将待检菌落接种THB 肉汤，于36℃培养18h±2h，取1.5ml 培养物经10 000r/min 离心3min，弃上清，加100µl 生理盐水将沉淀悬浮，取25µl 菌体悬液分别与猪链球菌标准血清和生理盐水进行玻片凝集试验，同时设阳性对照，生理盐水对照不凝集、阳性菌株凝集，试验成立。
（4）PCR 检测(https://www.daowen.com)
① 对病料分离的纯培养物可进行猪链球菌、猪链球菌1、2、7、9 型、猪链球菌毒力因子和猪链球菌MLST PCR（分子分型）检测，可用煮沸法提取细菌DNA，引物序列和退火温度见表3-1-2 ～表3-1-4。
表3-1-2 猪链球菌1、2、7、9 型和通用PCR 引物序列
表3-1-3 猪链球菌毒力因子PCR 引物序列
表3-1-4 猪链球菌MLST PCR 引物序列
（续表）
② 猪链球菌通用扩增体系：premix 12.5µl，ddH2O 8.5µl，引 物 各0.5µl，模 板2µl。扩增条件为：94℃预热5min；94℃30s，56℃ 30s，72℃ 1min，扩增30 个循环；72℃延伸10min（图3-1-4）。
图3-1-4 猪链球菌通用PCR 电泳图谱
③ 猪链球菌1、2、7、9 型扩增体系：premix 12.5µl，ddH2O 8.5µl，引物各1µl，模板2µl。扩增条件为：94℃预热5min；94℃ 30s，各自退火温度30s，72℃1min，扩增30 个循环；72℃延伸10min。
④ 猪链球菌7 个毒力因子扩增体系：可分为以下两个扩增体系。
a.扩 增 体 系1（fbps、gdh、orf 2 和mrp）：premix 12.5µl，引 物fbps 0.6µl、gdh 0.7µl、orf 2 1.2µl、mrp 0.2µl 各1µl，模板3µl，用ddH2O 调整终体积至25µl。扩增条件为：94℃预热5min；94℃ 30s，56℃30s，72℃ 1min，扩增40 个循环；72℃延伸10min。
b.扩增体系2（sly、gapdh、epf）：premix 12.5µl，引物sly、gapdh 各0.7µl，epf 0.2µl，DNA 模 板3µl，用ddH2O 调 整 终 体 积 至25µl。扩 增 条 件：94 ℃预 热5min，94 ℃30s，52℃30s，72℃1min，扩增40 个循环；72℃延伸10min。
⑤ 猪链球菌MLST 扩增体系：premix 12.5µl，ddH2O 8.5µl，引物各0.5µl，模板2µl。扩增条件：94℃预热3min；94℃30s，退火温度30s，72℃ 30s，30 个循环；72℃延伸10min。具体见图3-1-5。
图3-1-5 猪链球菌MLST PCR 电泳图谱
（a）aroA 基因；（b）cpn 基因；（c）dpr 基因；（d）gki 基因；（e）mutS 基因；（f）recA 基因；（g）thrA 基因