菌种保存与复苏技术
菌种保存技术是通过降低基质含水量、降低培养基营养成分、利用低温、降低氧分压等方法抑制细菌的新陈代谢，使其处于休眠或半休眠状态，以显著延缓菌种的衰老速度，降低发生变异的机会，从而使菌种存活并保持良好的遗传性状。菌种的复苏即菌种的活化，是将保藏状态的菌种接种到适宜的培养基，使其重新获得优良的生长活性和数量。
低温、干燥和隔绝氧气是目前降低细菌代谢能力的主要手段，所以菌种保存方法主要从这三个方面来设计。
常用的菌种保存方法大致可分为以下几种。
1.冷冻干燥
（1）原理：利用微生物细胞在冷冻、减压条件下发生升华脱水，细胞的生理活动趋于停止，得以长期维持存活状态；加水后又能迅速溶解，几乎可以立即恢复原来的性状。
（2）操作：具体的操作流程见图2-5-1。
图2-5-1 菌种冻干保存的操作流程
① 容器的选择：冻干采用的容器主要是安瓿瓶和玻璃瓶，实验室使用西林瓶保存操作更为方便。
② 冻干保护剂的选择：国内常用的保护剂主要为牛奶、蔗糖、明胶等。常用冻干保护剂的共熔点见表2-5-1。
③ 菌液的制备和分装：通常采用培养18～24h 的菌液，经离心、弃上清、加入保护剂混悬，也可用保护剂直接从固体培养基表面洗下菌落获得菌悬液，分装西林瓶、半盖胶塞后放入冻干机（图2-5-2）。
④ 冻干机的操作：制定冻干曲线并设置冻干参数，包括预冻的温度和时间（有些冻干机可设置预冻速率），第一阶段升华干燥的温度、真空度和时间，第二阶段升华干燥的温度、真空度和时间，运行程序，结束后在真空状态下压胶塞（图2-5-3）。
⑤ 真空度测定：使用疫苗真空检测仪进行测定，出现白色或紫色辉光的为合格（图2-5-4）。
表2-5-1 常用冻干保护剂的共熔点
注：引自王明俊等主编，兽医生物制品学。
图2-5-2 菌液的制备和分装
（a）菌悬液离心；（b）弃上清，取沉淀物；（c）加入适量保护剂；（d）混匀；
（e）取0.5ml 分装入西林瓶内；（f）半盖胶塞
图2-5-3 冻干机的操作
（a）制定冻干曲线；（b）设置冻干机参数并运行；（c）运行结束后压胶塞
图2-5-4 真空度检测
（a）白色辉光；（b）紫色辉光；（c）不合格
⑥ 剩余水分的测定：多采用真空烘干法测定剩余水分（图2-5-5）。使用快速水分测定仪则可大大提高其检测效率。
图2-5-5 真空烘干法测定剩余水分
（a）空称量瓶150℃烘烤2h，冷却后称重；（b）迅速将冻干产品倒入称量瓶；（c）称重；
（d）60～70℃真空干燥；（e）移入有CaCl2的干燥罐中冷却至室温
含水量不应超过4%。最终获得产品为奶片状的疏松固体物，经加铝盖贴标签后，在2～8℃条件下即可长期保存（图2-5-6）。
图2-5-6 冻干菌株封口和标记
（a）压盖；（b）标记
（3）适用：适用于大多数细菌、病毒、噬菌体、部分丝状真菌、酵母菌等的保存。
（4）保存周期：不同微生物的保存周期有所差异，通常可保存10 年左右甚至更长。
（5）复苏：吸取适量稀释液（如无菌生理盐水或培养液）加入冻干瓶中进行复水，使冻干样品溶解，然后将溶解液分别接种到液体培养基和固体培养基（图2-5-7）中进行培养。
2.低温保存
（1）液氮超低温保存
① 原理：微生物在-130℃以下新陈代谢趋于停止，可以长期、有效保存。
② 操作：将细菌加入含有冻存保护剂（如10%～20%甘油、5%～10%的二甲基亚砜等）的冻存管中混匀，经程控降温后，放置于液氮罐中保存（一般液相-196℃，气相-150℃）（图2-5-8）。(https://www.daowen.com)
③ 适用：各类微生物。
④ 保存周期：一般为10 年以上。
⑤ 复苏：从液氮中取出冻存管，立即投入37℃恒温水浴锅中迅速晃动，直至完全溶解。由于许多冷冻保护剂在常温下对细胞有害，故在复温后应及时接种培养。
（2）-80℃低温保存
图2-5-7 冻干菌种的复苏
（a）打开塑料盖，消毒瓶口；（b）注入适量稀释液；（c）划线接种；（d）剩余菌液移种液体培养基
图2-5-8 液氮保存
① 原理：利用低温条件可减缓微生物的新陈代谢，以达到有效的保存。
② 操作：操作基本与液氮保存相同，只是将冻存管放置于-80℃冰箱中保存，除加入冻存保护剂外，还可将菌种吸附在一些载体上进行保存（图2-5-9）。
图2-5-9 -80℃低温保存
（a）-80℃冰箱内冻存盒架；（b）菌种管（瓷珠）；（c）菌种管（甘油肉汤）
a.加入冻存保护剂，可避免或减少因冰晶产生和渗透压变化造成的细胞损伤，常用甘油和二甲基亚砜。适用于各类微生物，保存周期一般为1～2 年。
b.瓷珠为类似活性炭的多孔结构，吸附细菌后将液体移除，可有效减少冰晶和渗透压的影响。适用于各类微生物，可保存1～10 年。
c.滤纸吸附。将灭菌滤纸条浸入菌悬液内，取出后放入无菌容器中（常用安瓿管，也可用玻璃瓶、离心管等），经真空干燥后低温保存。适用于营养要求不高的细菌、酵母菌、丝状真菌的保存，但不适用于苛养菌的保存。细菌、酵母菌可保存2 年左右，有些丝状真菌甚至可保存14 年之久。
3.定期移植保存
2～8℃冷藏条件下保存可减缓微生物菌种的代谢活动，抑制其繁殖速度。保存培养基一般含较多有机氮而糖分总量不超过2%，这样既能满足菌种培养时生长繁殖的需要，又可防止因产酸过多而影响菌株的保存。此法同日常的传代没有本质区别，只是频次不同。
（1）半固体培养基保存
① 操作：用接种针挑取单菌落在半固体培养基上穿刺接种，经培养生长后，置试管架上于2～8℃保存，见图2-5-10。
图2-5-10 半固体培养基穿刺保存
② 适用：大多数细菌和真菌。
③ 保存周期：细菌传代每月1 次，霉菌、放线菌及有芽孢的细菌传代每2～4 月1 次。经液体石蜡封存，一般无芽孢细菌也可保存1 年左右，霉菌、放线菌、芽孢杆菌可保存2 年以上，酵母菌可保存1～2 年。
（2）斜面培养保存
① 操作：用接种环挑取单菌落在琼脂斜面上划线接种，经培养生长后，置试管架上于2～8℃保存（图2-5-11）。
② 适用：大多数细菌和真菌。
③ 保存周期：细菌传代每月1 次，霉菌、放线菌及有芽孢的细菌传代每2～4 月1 次。
图2-5-11 斜面培养保存