多杀性巴氏杆菌（P.multocida）

多杀性巴氏杆菌（P.multocida）

该菌在自然界分布广泛，在同种或不同种动物间可以相互传染。该菌主要通过接触传播，蜱和跳蚤是自然传播的媒介昆虫。1994 年该菌被列为3 个亚种，分别为多杀亚种、败血亚种和杀禽亚种。

1.形态染色

革兰阴性、两端钝圆的细小短杆菌或球杆菌（图6-1-1），大小为（0.25～ 0.4）µm×（0.5～2.5）µm，常单个存在，有时成双排列，无鞭毛和芽孢（图6-1-2）。病料涂片，用瑞氏或亚甲蓝染色时，可见菌体多呈两端浓染、中央部分着色较浅的典型两极着色，常有荚膜（图6-1-3）。

2.培养特性

（1）培养条件：需氧或兼性厌氧菌，最适温度为35～37℃。对营养要求较高，在营养琼脂培养基上生长贫瘠，在加有血清、血液的培养基中生长良好。

（2）常用培养基上的生长形态：在血平板（胰蛋白大豆琼脂、改良马丁琼脂、脑心浸液琼脂、哥伦比亚琼脂等均可）上37℃培养24h，呈湿润的露滴样小菌落或光滑的圆形菌落，菌落黏稠，不溶血（图6-1-4）。从病料中新分离的强毒菌株为较大的黏液型菌落（图6-1-5），具有荚膜。在麦康凯培养基上不生长。

不同菌株在血琼脂平板上形成3 种不同类型。

① 黏液型菌落（M 型）：菌落大而黏稠，边缘呈流动状，荧光较好，菌体有荚膜，从慢性病例或带菌动物病料中可分离到。

② 光滑型菌落（S 型）：菌落中等大小，对小白鼠毒力强，菌体有荚膜，可从急性病例中分离到。

③ 粗糙型菌落（R 型）：菌落小，分散，干，难乳化，菌体无荚膜，能自凝。

（3）血清肉汤培养：轻度混浊，试管底部出现黏稠状沉淀物，表面形成菌环。

（4）明胶穿刺培养：沿穿刺孔呈线状生长，上粗下细（图6-1-6）。

（5）三糖铁培养基：无黑色H2S 产生（图6-1-7）。

（6）改良马丁琼脂培养：不同来源的菌株因所含荚膜物质的差异，在改良马丁琼脂平板（4%血清和0.1%血红素）上培养18～22h 后，在45°折射光下用低倍显微镜观察，可呈现不同的荧光色泽。根据折射出荧光的色泽，将菌落分为Fg 型、Fo 型和Nf 型3 个型。具体差异见表6-1-1。

3.生化反应

本菌培养可分解葡萄糖、蔗糖、甘露糖、果糖和半乳糖，产酸不产气。大多数菌株可发酵甘露醇、山梨醇和木糖。一般不发酵乳糖、鼠李糖、杨苷、肌醇、菊糖、侧金盏花醇。可形成靛基质，触酶和氧化酶均为阳性，甲基红试验和V-P 试验均为阴性，石蕊牛乳无变化，不液化明胶，不产生硫化氢。与同属其他菌的生化反应差异详见表6-1-2。

4.分离鉴定

（1）多杀性巴氏杆菌分离鉴定流程：采取渗出液、心血、肝、脾、淋巴结等新鲜病料涂片或触片，以碱性亚甲蓝或瑞氏染色液染色，显微镜镜检是否有典型的两极着色的短杆菌。病料须接种血琼脂平板在5% CO2培养箱或烛缸中分离培养，急性死亡病例的病料可在含血清的马丁肉汤、TSA 中36℃增菌培养24～48h，取肉汤培养物接种血琼脂平板进行分离培养，疑似菌落接种三糖铁培养基和麦康凯培养基，在三糖铁培养基上底部变黄、不产生硫化氢，而在麦康凯培养基上不生长、不溶血可初步确定，再选择商品化试剂进行细菌鉴定。具体流程见图6-1-8。

（2）多杀性巴氏杆菌血清分型：本菌以其荚膜抗原和菌体抗原区分血清型，荚膜抗原有6 个型，用大写英文字母表示；菌体抗原有16 个型，用数字表示。我国禽源多杀性巴氏杆菌以5 ∶A 为主，猪以5 ∶A 和6 ∶B 为主，E 型不常见。其中，A、B 两型毒力最强，D型毒力较弱。

（3）毒力试验：用马丁肉汤培养物，稀释菌液浓度为103CFU/ml，皮下注射小白鼠4 只，每只0.2ml，同时设阴性对照。观察3～5 天，阴性对照成立，试验组全部死亡为阳性。死后取其肺进行涂片，用亚甲蓝染色或瑞氏染色后镜检或接种血琼脂平板后再证实。

（4）PCR 检测：对从病料分离的纯培养物进行多杀性巴氏杆菌产毒素、荚膜A 型、B型和D 型的PCR 检测。用煮沸法提取细菌DNA，反应体系和条件参照《猪巴氏杆菌病诊断技术》（NY/T 564—2016）。

① 多杀性巴氏杆菌PCR 扩增条件：95℃变性5min，95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，30 个循环；72℃延伸10min。

② 产毒素多杀性巴氏杆菌PCR 扩增条件：95℃变性5min，95℃变性30s，50℃退火1min，72℃延伸1min，30 个循环；72℃延伸7min。

③ 多杀性巴氏杆菌荚膜多重PCR 扩增条件（A 型、B 型和D 型）：95℃变性10min，95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，30 个循环；72℃延伸10min。