猪胸膜肺炎放线杆菌（A.pleuropneumoniae）

猪胸膜肺炎放线杆菌（A.pleuropneumoniae）

猪胸膜肺炎放线杆菌以前被称为副溶血嗜血杆菌，自1983 年起划归为放线杆菌属，改名猪胸膜肺炎放线杆菌，常引起猪传染性胸膜肺炎，是集约化养猪场常见的猪病之一。

1.形态染色

革兰阴性小球杆菌，具多形性，有时呈散在的线状或丝状。新鲜病料呈两极染色，有荚膜和鞭毛，具有运动性（图6-2-1）。

2.培养特性

兼性厌氧，初次分离应接种在含辅酶I（NAD）的血琼脂平板或巧克力琼脂平板。在绵羊血琼脂平板上，5% CO2培养箱中37℃培养24～48h 可产生稳定的β 溶血，呈露珠样、半透明菌落（图6-2-2）；在巧克力琼脂平板上为边缘整齐、隆起的灰白菌落（图6-2-3）；在10% CO2培养箱中培养可长出黏液性菌落。根据其对NAD 的依赖性，又分为生物Ⅰ型和Ⅱ型。Ⅰ型依赖NAD，需添加V 因子，常用巧克力培养基或含NAD 的绵羊血琼脂平板培养；Ⅱ型不依赖NAD，在绵羊血平板上可产生稳定的β 溶血，金黄色葡萄球菌可增强其溶血圈（CAMP 试验阳性）（图6-2-4）。多数菌株靠近表皮葡萄球菌的菌落较大，与表皮葡萄球菌生长线的距离增加而变小或不生长，即卫星现象（图6-2-5）。

3.生化反应

乳糖、蔗糖、麦芽糖、甘露醇、山梨醇、过氧化氢酶、尿素酶阳性；枸橼酸盐、MR、V-P 试验阴性，详见表6-2-1。需注意胸膜肺炎放线杆菌在进行生化试验时必须在相应的生化管中添加V 因子。

4.分离鉴定

（1）胸膜肺炎放线杆菌分离鉴定流程：将病料接种巧克力琼脂或添加NAD 血琼脂平板，置5% CO2、37℃恒温箱培养24h，如有溶血小菌落生长，涂片镜检为革兰阴性、两极染色的球杆菌，需进一步做CAMP 试验，检测其脲酶活性及甘露醇发酵能力，然后再选择商品化试剂进行细菌鉴定，具体流程见图6-2-6。

（2）血清分型：目前将本菌分为15 个血清型，Ⅰ型依赖NAD，包括1～12 及15 血清型；Ⅱ型不依赖NAD，含13、14 型。由于LPS 侧链及结构的相似性，某些型之间存在抗原性交叉。1、5、9、11 型血清型的毒力最强，3 和6 型毒力低。

（3）鉴别：胸膜肺炎放线杆菌与副猪嗜血杆菌非常相似，鉴别见表6-2-2。

（4）PCR 检测：对病料分离的纯培养物可进行PCR 检测，可用煮沸法提取细菌DNA，扩增片段长度449bp。

① 引物序列：APP-F：5′-CGTATTTGGCACTGACGGCGA-3′

APP-R：5′-CGGCCATCGACTCAACCATCT-3′

② 扩增体系：25µl 总体系。Premix 12.5µl，ddH2O 8.5µl，引物各1µl，DNA 模板2µl。

③ 扩增条件：95℃变性2min，94℃变性30s，57℃退火1min，72℃延伸45s，30 个循环； 72℃延伸10min。