副猪嗜血杆菌（H.parasuis，HPS）

副猪嗜血杆菌（H.parasuis，HPS）

该菌常存在于猪的上呼吸道，构成正常菌群，在猪抵抗力下降或应激因素作用下较易发病，且多为混合感染。发病猪表现为高热、关节肿胀、呼吸困难以及神经症状。

1.形态染色

革兰阴性小短杆菌，单个球杆状到长的、细长的以至丝状等多种不同形态，大小为1.5µm×（0.3～0.4）µm（图6-3-1），无鞭毛，无芽孢，新分离的致病菌株有荚膜。

2.培养特性

需氧或兼性厌氧，对营养要求较高，在普通培养基上不生长。初次分离培养需5%～10% CO2，37℃培养24～48h，生长需依赖含10µg/ml 以上的V 因子和X 因子。在巧克力琼脂平板上生长，呈针尖大小、无色透明、光滑湿润的菌落（图6-3-2）。在含有辅酶I（NAD）的TSA、Columbia 和BHI 平板上经48h 培养，生长较好，为针尖或露珠大小的灰白色半透明菌落，不溶血，重复培养菌落会变大。在血平板上密布划线接种本菌，用金黄色葡萄球菌垂直点种或划线，5%～10% CO2、37℃培养24h，愈靠近金黄色葡萄球菌周围生长的本菌菌落愈大，愈远的愈小，甚至不见菌落生长，即“卫星现象”阳性（图6-3-3）。因为金黄色葡萄球菌产生的溶血素可以迅速裂解生长线附近的红细胞，释放足量的X 因子和V 因子供副猪嗜血杆菌生长需要，金黄色葡萄球菌还可以沿生长线分泌NAD 到培养基中，从而产生“卫星现象”。本菌对外界抵抗力差，分离到的细菌需及时冻干保存或移植。

3.生化反应

副猪嗜血杆菌对糖类发酵多不稳定，葡萄糖、麦芽糖和半乳糖阳性，吲哚、脲酶、山梨糖和甘露醇阴性。

4.分离鉴定(https://www.daowen.com)

（1）分离鉴定流程：将病料接种到巧克力琼脂或含V 因子的血琼脂平板上，置5% CO2、37℃培养24～48h，如有针尖大小、无色透明、光滑湿润的菌落生长，涂片镜检为革兰阴性小短杆菌，多形性，有卫星现象。具体流程见图6-3-4。

（2）副猪嗜血杆菌与胸膜肺炎放线杆菌的鉴别：参考表6-2-2。

（3）PCR 检测：对病料分离的纯培养物进行PCR 检测，可选择煮沸法提取细菌DNA。扩增片段长度1 086bp。

① 引物序列 HPS-1：5′-TATCGRGAGATGAAAGAC-3′

HPS-2：5′-GTAATGTCTAAGGACTAG-3′

HPS-3：5′-CCTCGCGGCTTCGTC-3′

② 扩 增 体 系：25µl 总 体 系。Premix12.5µl，ddH2O 8.5µl，HPS-1 0.5µl，HPS-2 0.5µl，HPS-3 1µl，DNA 模板2µl。

③ 扩增条件：94℃变性3min；94℃变性1min，56℃退火45s，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸10min。