支原体（Mycoplasma）

第一节　支原体（Mycoplasma）

支原体（Mycoplasma）无细胞壁，具有多形性，能通过细菌滤器，常污染实验室培养的细胞及生物制品。对人或畜禽有致病性的有30 多种，其中对猪具有致病性的支原体有猪肺炎支原体、猪鼻支原体、猪滑液支原体等，对禽类具有致病性的支原体有鸡毒支原体、滑液囊支原体、火鸡支原体等。

支原体对培养基的要求较高，比一般细菌难培养。由于无细胞壁，对环境的影响更敏感，易被灭活。培养时需注意以下事项。

（1）支原体不耐干燥，用固体培养基培养时应保持一定湿度。

（2）初次分离的支原体多数为兼性厌氧，一般在5%～10% CO2和相对湿度80%～90%环境中均能生长，无条件时可用烛缸代替。

（3）固体培养基菌落小，必须在低倍显微镜下才能观察到。

（4）固体培养基琼脂浓度应小于1.2%，以利于“油煎荷包蛋”状典型菌落的形成。

（5）支原体在液体培养基中生长量较少，培养基清亮，观察时需与未接种管作对比来识别，通常要作4～5 代连续移植来提高分离率。

（6）将无菌病料用液体培养基稀释，37℃培养2～7 天。污染的病料可过滤除菌后接种。

（7）新分离菌株在鉴定前必须先进行细菌L 型鉴定和2～3 次克隆、纯化。支原体在不含青霉素的培养基中连续传代5 次，不恢复为细菌形态；细菌L 型是将液体培养物通过0.45µm 孔径滤器过滤后，再固体培养，挑选散在、单个菌落液体培养，连续2～3 次。支原体与细菌L 型极相似，在检测过程中较难区分，其区别见表11-1-1。

附录 常用培养基

（1）A26 液体培养基（1000ml）

Hartley 氏牛心消化汤：300ml 1%水解乳蛋白物Hank′s 氏液：490ml

调节pH 为7.6，115℃高压蒸汽灭菌10min，冷却至55～60℃时，添加以下无菌的或过滤除菌的成分，混匀。

青霉素溶液（100 000IU/ml）：2.0ml 健康猪血清：200ml

鲜酵母酸浸液：5.5ml 5%醋酸铊溶液：2.5ml

（2）A26 固体培养基（1000ml）

Hartley 氏牛心消化汤：300ml 1%水解乳蛋白物Hank′s 氏液：490ml

0.9%琼脂：9g

调节pH 为7.6，115℃高压蒸汽灭菌10min，冷却至55～60℃时，添加以下无菌的或过滤除菌成分，混匀后，倾倒平板。

青霉素溶液（100 000IU/ml）：2.0ml 健康猪血清：200ml

鲜酵母酸浸液：5.5ml 5%醋酸铊溶液：2.5ml(https://www.daowen.com)

（3）改良Frey 氏培养基配方

基础液：

NaCl：5g KH2PO4：0.1g KCl：0.4g MgSO4·7H2O：0.2g

Na2HPO4：1.6g 葡萄糖：10g 水解乳蛋白：5g 去离子水：1 000ml

培养液：

基础液：88% 灭活猪血清：12% 醋酸铊：0.012 5%

青霉素：1 000U/ml 辅酶（NAD+）：0.01% 酚红：0.002%

取基础液88%，用0.1M 的NaOH 调制pH 至7.7～7.8，121℃高压灭菌15min，冷却至55～60℃时，添加其余已过滤除菌的成分，混匀，分装。

（4）ATCC 培养基—1699 Revised Mycoplasma Medium（改良支原体培养基）

心浸液肉汤：7.5g 琼脂：10g 去离子水：660ml

调节pH 为7.4，121℃高压灭菌15min，冷却至55～60℃时，添加以下已过滤除菌的成分，混匀后，倾倒平板。

Hank′s 平衡盐溶液（10×）：40ml PBS 缓冲液（含5%水解乳蛋白）：100ml

20%健康猪血清（灭活）：200ml 酵母浸出液：20ml 0.25%酚红：10ml

（5）Hank′s 平衡盐溶液（1 000ml）

NaCl：80g Na2HPO4·7H2O：0.9g CaCl2：1.4g KCl：4g

KH2PO4：0.6g MgCl2·6H2O：1.0g MgSO4·7H2O：0.9g 葡萄糖：10g

（6）双相培养基

固体培养基斜面在底部，在上部加入液体培养基。